دامپزشكي

**CASSIATORA** · Jun-21-2008, 20:18

عفونت ویروسی مفصل(عفونت و آب اوردگی مفصل ویروسی)

وقوع :جهانی

گونه اثر : همه پرندگان

سن اثر: 3 تا 30 هفتگی

در گوشتی در 5 تا8 هفتگی ودر پولت مادر در 10 تا 18 هفتگی از سن رخ می دهد

سبب : دو برابر میزان استاندارد r. n .a reovirus

تاثیر : نهفتگی 9 تا 13 روز است پرندگان روی زانو می نشینندواز رشدشان کاسته می شود.عدم تمایل به حرکت و گام برداشتن نا هماهنگ از دیگر نشانه هاست.

تجمع آل در بال و پایین مفصل زانو و گسیختگی عضله گاستروس نمیوس معمولا ظاهر می شود

عوارض به تفضیل:

همه پرندگان از سن 3 تا 30 هفتگی مستعد ابتلا شدید به این بیماری تضعیف کننده هستند در جوجه ها از 5 تا 8 هفتگی و در بقیه در سن 10تا 18 هفتگی بیماری حادث می شود بیماری به علت رئوویروس ها ( به شکل تنفسی گوارشی و حلقی ) حاصل می شود

روش انتقال

انتقال عرضی از پرنده به پرنده و یا عمودی از مرغ به نتاج دیده شده است از طریق مدفوعی دهانی و یا تنفسی انتقال می تواند رخ دهد

یادداشت ویژه

آن معمولا باعث کاهش درجه و ظاهر بد در جوجه ها و گله پرندگان می شود

نشانه های کلینیکی

کمون بیماری 9 تا 13 روز است پرندگان روی زانو ها می نشینند رشد کمی دارند و بی میل به حرکت و گام نا هماهنگ دارند و معمولا پارگی تاندون گاستروس نمیوس دیده می شود

جراحات بعد مرگ

آماس دو طرفه در تاندون عضلات digital flexor و metatarsal extensor قابل تشخیص است افزایش سلول التهابی و مایع غلیظ در مفاصل و اماس در footpad واکسودا با رنگ کاهی تا قرمز کم رنگ در جراحات قابل مشاهده است

گسیختگی تاندون ها و خونریزی در پرده سینوویال مفاصل و فساد غضروف های distal tibiotarsus می تواند رخ دهد کندیل ها (joint capsule) می توانند نیز در گیر شوند.

تشخیص ها

جداسازی ویروس ها از آسیب های وارده روی پرده cam در اثر تلقیح به جنین و تست سرولوژیک برای آنتی بادی va ( vn یا elisa ) از محدود روش های مورد استفاده هستند زیرا پرنده ها معمولا با رئوویروس های غیر پاتوژنیک آلوده می شوند

آثار هیستو پاتولوژی ، ظهور ادم ، نکروز انعقاد ی ، انباشتگی گلبول های سفید و تصفیه گلومرولی، هیپر تروفی و هیپر پلازی سلول های سینوویال و تصفیه لنفوسیتی و ماکرو فاژی و رتیکولار محسوس هستند

Va بیشتر باعث تغییر رنگ مایع مخاطی به زرد کم رنگ تا خاکستری ، مایکوپلاسما سینوویه موجب رنگ عسلی مایع مخاطی و استافیلوکوکوس موجب ایجاد مایع سفید ضخیم در مفصل متورم می شوند.

توده ها وجراحات میکروسکوپی قابل ملاحظه اند.گسیختگی تاندون گاسترو نمیوس نیز ازمشخصات قابل ملاحظه است.

درمان و کنترل

جلوگیری

واکسیناسیون گله مادر در سن قبل 20 هفتگی با ویروس سویهs1133 صورت می گیرد . معمولا در سن 2 هفتگی (sq یا با آب ) و یا بین 6 تا 10 هفتگی (با آب ) به صورت زنده واکسینه می کنند .بعد 18 هفتگی و شاید بار دگر در 40 هفتگی با واکسن کشته به صورت تزریق SQ واکسینه می شوند

در بیشتر کشور ها واکسن دادن با آب مجاز نیست و SQ عمومیت دارد

واکسن زنده تخفیف حدت یافته به نسبت 1 به 3 رقیق می شود در ناحیه مشکل دار در یک روزگی برای بویلر به صورت 1 دوز کامل از HVT یا با اسپری سریع در سن 1 روزگی با 1 دوز کامل تزریق می شوددر سن بالاتر از 7 تا 10 روز نیز با روش آشامیدنی در پارهای از مواقع انجام شد که در بیشتر کشور ها این مجاز نییست

درمان

درمان مشخص ندارد آنتی بیوتیک ها در جلوگیری از عفونت ثانویه استاف مورد استفاده اند.

**CASSIATORA** · Jun-21-2008, 20:23

كلستریدیم بوتولینوم

كلستریدیوم بوتولینوم عامل بیماری بوتولیسم بوده و گسترش جهانی دارد این بیماری در اثر تاثیر زهرابه باكتری بر انتهای اعصاب حركتی ایجاد می شود و به مرگ در اثر نارسایی تنفسی منجر میگردد (لغت بوتولیسم از كلمه یونانی botulus به معنی سوسیس گرفته شده است. اولین همه گیرهای مسمومیت در ارتباط با سوسیس و سایر غذاهای آماده در قرن 19 میلادی به وقوع پیوست). بوتولیسم را مدتهاست به عنوان بیماری انسانی می شناسند.
مولر (Muller ) در سال 1870 این سم را برای این بیماری بكار برد ولی عامل بیماری در سال 1897بوسیله وان ارمنگم (Van Ermengem ) شناخته شد.او در بررسی این بیماری در بلژیك كه عده ای در اثر خوردن گوشت خوك دودی مبتلا و تلف شده بودند عامل بیماری را از گوشت خوك و از بافتهای افراد تلف شده جدا ساخت و تاثیر زهرابه میكروب را بر رشته های عصبی نشان داد.بوتولیسم به عنوان بیماری دامها در اوایل قرن 20 بتدریج شناخته شده است.

خصوصیات و مورفولوژی باكتری:
این باكتری میله ای شكل گرم مثبت (همانند سایر كلستریدیومها در كشتهای تازه و جوان گرم مثبت است ولی در اثر كهنه شدن به تدریج گرم منفی می شود) و اسپورزا می باشد. حدود 3 تا میكرون طول و 0.6 تا 0.8 میكرون عرض دارد.در خاك لاشه مرده مهره داران و بی مهرگان و دستگاه گوارش و گاهی مدفوع حیوانات حضور دارد.
فرم رویشی باكتری قادر نیست با فلور روده رقابت كند.در كشتهای تازه و جوان بدلیل دارا بودن تاژكهای جانبی دارای حركت بوده اما به زودی در نتیجه تولید اسپور فراوان بی حركت می شود. اسپور مركزی یا نزدیك به انتهایی دارد (در مركز و یا نزدیك به انتهای باكتری ایجاد می شود) بیضی شكل و درشت تر از عرض باتری است و باعث تورم باكتری می شود.
اسپور این باكتری شدیدا به حرارت مقاوم بوده و حرارت 100 درجه سانتیگراد را حداقل 3 تا 5 ساعت تحمل می كند خاصیت مقاومت به حرارت در pH اسیدی یا غلظت بالای نمك كاهش می یابد.

خصوصیات كشت و بیوشیمیایی:
این باكتری بیهوازی مطلق بوده در دمای 25 تا 30 درجه به خوبی رشد می كند در دمای 37 درجه سرعت رشدی كمتر از 30 درجه دارد. محیطهای اندكی قلیایی برای رشد میكروب مناسب تر است. باكتری در محیطهای مایع به ویژه آبگوشت حاوی قطعات كبد به فراوانی رشد می كند و اگر مقدار 5% گلوكز و 5% فسفات دی پتاسیك به محیط كشت افزوده شود رشد فراوانتر خواهد بود.

كلونی های باكتری در سطح محیط آگار و در شرایط بیهوازی كوچك نامنظم نیمه شفاف به رنگ سفید مایل به خاكستری تا قهوه ای متمایل به زرد و دارای سطحی گرانولار (دان دان) دیده می شود.

كلونی در عمق محیط كرك دار است. كلستریدیوم بوتولینوم ژلاتین را ذوب می كند(در سویه های مختلف متغیر است). گلوكز را بطور كامل و فروكتوز ساكاروز مالتوز و سالیسین را بطور متغیر( بسته به سویه های مختلف مثبت یا منفی بودن آن متفاوت است) تخمیر می كند اما قادر به تخمیر لاكتوز و زایلوز نیستند. تخمیر با تولید گاز همراه است و مواد حاصل از تخمیر مقدار زیادی اسید استیك است اسیدهای چرب دیگری نیز ایجاد می شود كه مقدار و نوع آن بر حسب سویه باكتری متفاوت است و شامل اسیدهای بوتیریك ایزوبوتیریك والریك و ایزوكاپروئیك است.
تست لیپاز مثبت دارند اما تستهای اندول و نیترات و اوره آنها منفی است از نظر تاثیر بر مواد پروتئینی بعضی از سویه ها پروتئولیتیك و بعضی دیگر غیر پروتئولیتیك هستند. سویه های پروتئولیتیك كلستریدیوم بوتولینوم را پارابوتولینوم هم می گویند كه این سویه ها شیر را به كندی منعقد و لخته حاصل را هضم می كنند.سرم منعقد و سفیده تخم مرغ بسته شده را هضم و محیط را كدر و بوی بد و نامطبوعی تولید می كنند. در محیطهای حاوی تكه های مغز و گوشت نیز در اثر هضم این بافتها بوی زننده ای ایجاد می نمایند.

زهرابه زایی:
كلستریدیوم بوتولینوم را بر اساس تفاوتهای آنتی ژنی و نوع توكسین و یا در اینجا بهتر بگوییم نوع نوروتوكسینی كه تولید می كند به 8 تیپ مختلف تقسیم بندی می كنند كه از A تا G نامگذاری شده اند و خود تیپ C در واقع دو تیپ C آلفا و C بتا می باشد.

لازم به ذكر است كه تیپ G از كلستریدیوم بوتولینوم با نام دیگری هم گفته شده و در واقع خود یه گونه از كلستریدیوم ها محسوب شده است با نام كلستریدیوم آرژانتینس ( Cl.argantines ). هر كدام از این تیپ ها زهرابه هایی با همنام تیپ خود تولید می كنند اما بعضی از تیپ ها مقداری از توكسین تیپ دیگر را هم می تواند تولید كند
تیپ A زهرابه A _ تیپ B زهرابه B _ تیپ C آ لفا زهرابه C1 و مقدار كمی هم C2 _ تیپ C بتا زهرابه C2 و مقدار كمی زهرابه C1 _ تیپ D زهرابه Dو همچنین C2 _تیپ E زهرابه E _تیپ F زهرابه F و تیپ G زهرابه G را تولید می كند. این زهرابه ها همانند سایر جنس های كلستریدیومها نسبت به گرما حساس می باشند تیپ های A- B- E- F و G در انسان ایجاد بیماری میكنند و سایر تیپ ها یعنی C و D در حیوانات موجب بیماری می شوند. البته تیپ E به صورت یک ارگانیسم بومی در محوطه های آبزیان هم مطرح می باشد که بیماری از طریق استفاده این محصولات ایجاد می شود.
بطور كلی سم بوتولیسم یك زهرابه پروتئینی است با وزن مولكولی 150 هزار دالتون كه از دو زنجیره سنگین و سبك تشكیل شده و وزن مولكولی آنها به ترتیب 100هزار و 50 هزار دالتون تخمین زده می شود. سنتز این سم پروتئینی توسط نوعی فاژ لیزوژنی ( Lysogenic phage ) صورت می گیرد.
به مولكول زهرابه یك پروتئین با خاصیت هماگلوتینین ( Hemagglutinin ) یعنی خاصیتی كه باعث جمع شدن گلبولهای قرمز خون می شوند متصل است كه زهرابه را در برابر آنزیمهای دستگاه گوارش محفوظ می دارد. سویه های غیر پروتئولیتیك كلستریدیوم بوتولینوم شامل C D E G و تعداد كمی از سویه های B و F هستند كه جهت بروز حداكثر قدرت زهرآگینی خود باید در معرض آنزیمهای پروتئولیتیك مانند تریپسین قرار گیرند. سم كلستریدیم بوتولینوم كشنده ترین سمی است كه تا كنون شناخته شده. 1 میلی گرم توكسین آن حاوی 120 میلیون دز كشنده برای موش است و 1هزارم میلی گرم آن برای انسان كشنده است.

حساسیت:
انسان به بوتولیسم حساس بوده و بطوریكه در اول مبحث گفته شد بیماری ابتدا در انسان تشخیص داده شد و مدتها آنرا فقط یك بیماری انسانی می دانستند.در حیوانات بوتولیسم بیشتر در پرندگان و به ویژه ماكیان و پرندگان وحشی آبزی بروز می كند اما حساسترین حیوان به بوتولیسم جوجه بوقلمون است. گاو گوسفند و اسب نیز نسبت به بیماری حساسند ولی خوك و گوشتخواران را مقاوم می دانند گرچه ابتلاء توله سگها به تیپ C كلستریدیوم بوتولینوم گزارش شده است.تیپ های مختلف این باكتری موش خوكچه هندی خرگوش مینك (سمور یا راسو) و موش خرما را در شرایط تجربی تلف می كند.

منشاء آلودگی و انتقال:
اسپورهای كلستریدیوم بوتولینوم به وفور در خاك یافت می شود و موجب آلودگی گوشت و سبزیجات می گردند.اسپورها در مواد غذایی و خوراكی كه بدون رعایت شرایط بهداشتی و استریلیزاسیون مناسب كنسرو شده اند زنده می مانند و در محیط بیهوازی قوطی كنسرو جوانه می زنند. سم در غذای كنسرو شده (كه شرایط بیهوازی مهیا است) تولید می شود و بصورت از پیش تعیین شده در هنگام بلع غذای مسموم وارد بدن می گردد از اینرو این بیماری غالبا یك عفونت نیست. غذاهای كه بیشترین خطر مسمومیت را دارند عبارتند از: كنسروها به ویژه كنسروهای سبزیجات(مخصوصا سبزیجات قلیایی) مانند مارچوبه اسفناج نخودفرنگی لوبیا قارچ و فلفل و در مرحله بعد كنسروهای گوشتی و ماهی.علاوه بر آن فراورده های دیگری مثل انواع ماهی دودی بسته بندی شده نیز در معرض خطر این آلودگی می باشند. در لبنیات به ویژه در كشك آلودگی به ندرت دیده شده است. بطور كلی %90 آلودگیهای بوتولیسم مربوط به كنسروهایی می شوند كه در تهیه آنها موازین بهداشتی و تكنولوژیك رعایت نشده است.

بطور كلی برای ایجاد توكسین یا سم در مواد غذایی توسط این باكتری شرایط زیر لازم است:

1- محیط بیهوازی: كه معمولا در قوطیهای كنسرو وجود دارد و نیز در ظروف در بسته با كمك مصرف اكسیژن توسط سایر میكرو ارگانیسمهای هوازی ایجاد می گردد.

2- درجه حرارت مناسب جهت تكثیر كلستریدیوم بوتولینوم: كه برای تیپ های A و B به ترتیب بین 10 تا 12.5 و 47.5 تا 50 درجه سانتیگراد می باشد .تیپ E به عنوان یك باكتری Psychrotroph شناخته شده و می تواند در عرض مدت 31 الی 45 روز حتی در برودت و سرمای 3.3+ درجه نیز توكسین تولید نماید.همانطور كه گفته شد این سم نسبت به حرارت آسیب پذیر است و در اثر چند دقیقه جوشاندغیر فعال می شود.با گرم كردن كافی غذا می توان از ابتلای به بیماری جلوگیری كرد.

در حیوانات: اسپور بوتولیسم كه در خاك مناطق مختلف وجود دارد به همراه علوفه وارد دستگاه گوارش حیوان شده و به این وسیله ممكن است به منطقه جدیدی نفوذ كند و خاك را آلوده سازد. همچنین مدفوع و لاشه دامها و طیور آب و خاك را آلوده می سازند. همانطور كه گفته شد بوتولیسم در حقیقت یك نوع مسمومیت محسوب می شود و بطور كلی در دستگاه گوارش توكسین تولید نمی كند با وجود این گزارشاتی مبنی بر تولید توكسین این باكتری در چینه دان مرغها و دستگاه گوارش نوزادان انسان داده شده است.همچنین موارد نادری از بوتولیسم در اثر آلوده شدن زخم در انسان و كره اسبها گزارش شده است ولی به غیر از موارد گفته شده بوتولیسم تقریبا همیشه در اثر خوردن غذاهای آلوده به توكسین این باكتری ایجاد می شود.
زهرابه ممكن است در لاشه متلاشی شده حیوانات تولید شود و دامها در اثر خوردن لاشه یا مصرف علوفه ای كه با لاشه آلوده شده باشد به بیماری مبتلا گردند. لاروهای مگس كه در لاشه حیوانات رشد كرده اند ممكن است حاوی مقدار كافی زهرابه باشد و مرغهایی كه از لاشه تغذیه می كنند مبتلا سازند.
منابع دیگر آلودگی گیاهان فاسد شده حاشیه بركه ها و دریاچه هاست كه ممكن است محل مناسبی برای تولید توكسین این باكتری باشد و پرندگان آبزی را كه از این گیاهان تغذیه می كنند به بوتولیسم مبتلا سازد. فقر كلسیم ممكن است گاوان و گوسفندان را وادار به خوردن لاشه فاسد حیوانات كند و این امر باعث بروز بوتولیسم در آنها شود.

بیماری زایی:

پس از بلع ماده غذایی یا عوامل آلوده سم از جدار روده ها گذشته و وارد جریان خون و لنف می شود. وجود هماگلوتینین در زهرابه آنرا در برابر ژانزیمهای گوارشی حفظ می كند.سم از طریق خون به گیرنده های غشایی پیش سیناپسی نورون های حركتی در سیستم اعصاب محیطی و اعصاب جمجمه ای متصل میشود از آنجا كه این سم در واقع یك پروتئاز است باعث لیز و تخریب پروتئینهای دخیل در آزاد سازی استیل كولین در نورون ها می شود و رها سازی استیل كولین را به فضای سیناپسی مهار می كند و از انقباض عضلانی جلو گیری كرده و در نتیجه به شلی و فلج عضلانی می انجامد و در اثر فلج عضلات تنفس بیمار می میرد.( استیل كولین یك میانجی گر شیمیایی در اعصاب است كه باعث انتقال پیامهای عصبی در رشته های عصبی شده و در نهایت در عضلات انقباض رخ می دهد _ در سم بوتولیسم آن قسمتی كه باعث تخریب پروتئینهای مسئول آزادسازی استیل كولین می شود زنجیره سبك سم است). سم بوتولیسم بر اعصاب كلی نرژیك سطحی اثر می كند اما سد خونی- مغزی مانع نفوذ آن به مراكز عصبی می باشد.

علائم بوتولیسم:
در انسان: علائم بالینی بیماری طی 12 تا 36 ساعت (و به ندرت تا 48 ساعت و بیشتر) پس از مصرف غذای مسموم به صورت ضعف و فلج پایین رونده پدید می آید: ضعف weakness خستگی عمومی و سر درد.اختلالات در بینایی بطوری كه دو بینی Double Vision یا Diplopia از عادی ترین علائم بوتولیسم است و همچنین تیرگی دید Blurred Vision و گشاد شدن مردمك Dilation of Pupils و تورم پلكها و اختلال در عمل تطابق. عضلات زبان فلج می شوند و اختلال در تكلم بوجود می آید و بلع غذا در ابتدا مشكل Dysphagia و بعد غیر ممكن می شود. نهایتا به دلیل فلج عضلات تنفسی و ایست قلبی مرگ اتفاق می افتد.

در این بیماری بر خلاف سایر مسمومیتهای غذایی علائم گوارشی معمولا بارز نیستند و تب وجود ندارد. میزان مرگ و میر به شدت مسمومیت بستگی دارد اما بطور كلی میزان مرگ و میر در این مسمومیت بالاست. بسیاری از موارد پس از 20 الی 24 ساعت منجر به مرگ می شود ولی در صورتیكه بیماران مسموم 10 روز اول بیماری را بگذرانند معمولا خطر مرگ منتفی خواهد بود. علاوه بر مورد فوق دو شكل اختصاصی بالینی رخ می دهد كه به غیر از راه خوردن غذای مسموم است:

۱- بوتولیسم زخم یا Wound Botulism :

در اینحالت اسپورها زخم را آلوده كرده و جوانه می زنند و در محل زخم توكسین تولید می كنند. بوتولیسم زخم با اعتیاد تزریقی (به خصوص استفاده از هروئین) ارتباط دارد.

۲- بوتولیسم نوزادان یا Infant Botulism :
در آن باكتری در روده رشد و تكثیر كرده و سم تولید می كند.
سپس سم از روده جذب شده و این امر به آهستگی صورت می گیرد. به این نوع از بوتولیسم Floppy Baby Syndrome هم می گویند. خوردن عسل آلوده به این باكتری در انتقال بوتولیسم نوزادان نقش دارد.نوزادان مبتلا دچار ضعف یا فلج می شوند و ممكن است به اقدامهای حمایتی جهت تنفس نیاز داشته باشند ولی معمولا به طور خودبخود بهبود می یابند.

بوتولیسم نوزادان یكی از علل سندرم مرگ ناگهانی نوزادان است. در حیوانات: بوتولیسم در گاو گوسفند و اسب بیشتر به وسیله باكتری های تیپ C بتا و D و به ندرت تیپ B گزارش شده است.
تیپ D این باكتری بیماری Lamziekte را در مناطقی از آفریقا در گاو ایجاد می كند. در این مناطق گاوان در اثر كمبود و فقر غذایی به مردار خواری عادت می كنند. گزارشهای متعددی از بیماری بوتولیسم در اسب در نتیجه مصرف علوفه فاسد و آلوده وجود دارد (در نواحی غربی اروپا) كه با ابتلا و تلفات قابل ملاحظه ای همراه بوده است.
علائم اغلب 3 تا 7 روز پس از خوردن مواد آلوده به زهرابه باكتری بروز می كند. مسلما هر چه مقدار زهرابه بیشتر باشد دوره كمون و نهفته بیماری كوتاه تر است. در اشكال فوق حاد حیوان بدون بروز علائم تلف می شود. تب وجود ندارد و بیماری منظره فلج عضلانی رو به پیشرفت را مجسم می كند. ضعف و فلج عضلات از پاهای عقب شروع شده و تا پاهای جلو و سر و گردن توسعه می یابد.

در بیشتر موارد بیماری تحت حاد است. تلو تلو خوردن لغزیدن ناتوانی در برخاستن از آثار این بیماری است. دام مبتلا به روی جناغ سینه خوابیده و سر را روی زمین و یا به پهلوی خود تكیه می دهد كه بی شباهت به فلج پس از زایمان نیست. زبان فلج و از دهان خارج می شود و حیوان قادر به جویدن و بلع غذا نیست و بزاق ازدهانش سرازیر می شود. دفع ادرار و مدفوع كمتر ممكن است تغییر كند. فلج عضلات سینه در اواخر بیماری منجر به تنفس شكمی می شود. از حساسیت و هوشیاری حیوان تا آخر كاسته نمی شود. 1 تا 4 روز پس از بروز علائم حیوان می میرد. گاهی در شرایط طبیعی و یا در موارد تجربی گاوها علائم خفیفی نشان می دهند و پس از 3 تا 4 هفته بهبود پیدا می كنند.
حیواناتی كه بهبود یافته اند تا مدتی از نظر اخذ غذابا اشكال روبرو هستند. مطابق بررسی های صورت گرفته میكروارگانیسم هایی كه در چهار معده نشخوار كنندگان وجود دارند قدرت زهرآگینی این باكتری را كاهش می دهند بنابراین قدرت كشندگی زهرابه از راه دهان در گاو خیلی بیشتر از سایر راههاست.

نوع ویژه ای از بوتولیسم در اثر نفوذ باكتری در جراحات نكروتیك در كره اسب های جوان درسنین 3 تا 8 هفتگی در ایالات متحده استرالیا و انگلستان شناخته شده كه چون با نشانی های لرزش همراه است آنرا سندرم كره های لرزان یا Shaker Foal Syndrome نامیده اند و در حقیقت نوعی مسمومیت عفونی (Toxicoinfection) می باشد. این بیماری بطور ناگهانی با ضعف شدید عضلات و زمین گیر شدن آغاز می شود كره های مبتلا قادر به بزخاستن نمی باشند اگر آنها را سز پا نگه دارند لرزش شدید عضلانی در آنها ایجاد می شود. لرزش در هنگامی كه كره زمین گیر شده و دراز كشیده است آشكار نمی باشد.

اگر كره قادر به راه رفتن باشد قدمها ناموزون می باشد. اگر پستان مادر را بگیرد شیر از دهانش به خارج می ریزد. اگر برای خوردن علف كوشش كند برخی از آن از منخرینش خارج می شود. كره مبتلا به یبوست است.
مرگ در اثر فلج عضلات تنفس حدود 72 ساعت پس از بروز علائم فرا می رسد. بعضی از كره ها پس از 14 روز بهبود می یابند. در پرندگان: علائم در پرندگان چند ساعت تا یكی دو روز پس از خوردن مواد آلوده بروز می كند. تا كنون بیشتر تیپ C آلفا را عامل ابتلاء پرندگان تشخیص داده اند. مرغ مبتلا كسل و بی اشتهاست چشمها نیمه بسته و كم فروغ است.عضلات پا و بال زودتر از سایر قسمتها مبتلا می شود.مرغ به زحمت جابجا می شود بالهایش روی زمین آویخته است.در اثر فلج عضلات گردن سر به طرف پایین می افتد و مرغ قادر به نگاه داری سر بطور عادی نیست بدین جهت به بیماری نرمی گردن یا Limberneck معروف است.

در بعضی از موارد شدید پرهای مرغ می ریزد. بطور كلی در این بیماری پر حیوان زود كنده می شود.سرانجام بیماری و سیر آن به میزان زهرابه خورده شده بستگی دارد. در موارد شدید ظرف مدت چند ساعت تا 1 روز منجر به مرگ می شود ولی در اشكال خفیف تر به تدریج علائم مرتفع می شود و سلامت خود را به دست می آورد. آثار كالبد گشایی: در كالبد گشایی تغییرات مشخصی دیده نمی شود. گرچه وجود مواد خارجی مظنون در دستگاه گوارش نشخوار كنندگان و اسب ممكن است نظر را متوجه این بیماری نماید. گاهی زیر پرده داخلی و خارجی قلب خونریزی وجود دارد و پرخونی در مخاط روده ها دیده می شود. خونریزی در اطراف عروق مغزی گزارش شده و ممكن است سلولهای پوركنژ در مخچه از بین رفته باشد.

تشخیص:
گرچه با توجه به علائم می نوان به موارد انفرادی بوتولیسم مشكوك شد ولی تشخیص قطعی بوتولیسم بوسیله جستجوی زهرابه باكتری در مواد غذایی خورده شده و یا محتویات گوارش دامها و یا افراد تلف شده و شناسایی آن و تزریق به حیوان آزمایشگاهی (موش) امكان پذیر است. برای این منظور: مقداری از مواد غذایی خورده شده را در سرم فیزیولوژی استرسل له كرده و بصورت شیرابه در آورده و سپس آنرا از پالا می گذرانیم تا میكروبهای موجود در آن گرفته شود. مقداری از شیرابه پالا شده را به مدت 15 دقیقه می جوشانیم. 0.5 میلی لیتر تزریق داخل صفاقی (IP ) از شیرابه جوشانده شده به موش این حیوان را تلف نمی كند در صورتیكه تزریق همین مقدار از شیرابه جوشیده نشده موجب مرگ حیوان می گردد. قابل ذكر است كه مخلوط كردن سرم ضد بوتولیسم یا آنتی توكسین با عصاره مزبور موجب خنثی شدن زهرابه می شود.

تشخیص تفریقی:
بیماری بوتولیسم با فلج پس از زایمان در گاو و كمبود كلسیم در گوسفند بی شباهت نیست ولی شرایط ایجاد بیماری در آنها كاملا متفاوت است. هاری فلجی در گاو و انسفالومیلیت در اسب بیماری لوپینگ ایل و اسكرپی در گوسفند و بعضی از مسمومیتهای گیاهی در دامها ممكن است با بوتولیسم اشتباه شود.

درمان:
در انسان در كنار انجام اقدامات حمایتی تنفسی به بیمار آنتی توكسین پلی والان یا سه ظرفیتی ( A B , و E ) داده می شود.این آنتی توكسین در بدن اسب ها ساخته می شود از اینرو حدود %15 از گیرندگان آنتی بادی سرمی به بیماری سرم دچار می شوند. در حیوانات سرمهای حاوی پادزهر اختصاصی و یا پلی والان را نیز می توان در مراحل ابتدایی بیماری بكار برد ولی مؤثر بودن آن مورد تردید است.
تجویز مسهل برای خروج زهرابه از روده ها و داروهای محرك اعصاب گاهی صورت می گیرد. اینگونه معالجات در اسب همراه با وارد ساختن مواد غذایی بوسیله لوله معدی تقویت می شود. بطور كلی درمان در موارد تحت حاد كه بیماری با كندی پیشرفت می كند ممكن است با موفقیت همراه باشد كه در اینگونه موارد باید بقیه حیوانات سالم را مایه كوبی نمود.

پیشگیری:
از آنجایی كه اسپور این باكتری بطور گسترده ای در خاك پراكنده است سبزیجات میوه ها و مواد دیگر می توانندآلوده شوند. غذاهای كنسرو شده و همچنین غذاهای بسته بندی شده در منزل باید به مقدار كافی حرارت ببینند و یا به مدت 20 دقیقه جوشانده شوند.
در حال حاضر خطر عمده ناشی از غذاهای بسته بندی شده در منزل است(بخصوص لوبیا سبز- نخود فرنگی- ذرت- فلفل- زیتون و ماهی دودی).از مصرف كنسروهایی مه سر و ته آنها بر آمده و باد كرده است اكیدا اجتناب شود (آنزیمهای پروتئولیتیك كلستریدیایی باعث تشكیل گاز و متورم شدن قوطی می شوند).غذاهای مسموم ممكن است فاسد یا ترش شوند و همانطور كه گفته شد ممكن است كنسروها تورم پیدا می كنند و یا ظاهر طبیعی داشته باشند. در حیوانات در دامهایی كه در چراگاه نگهداری می شوند باید كمبود مواد غذایی را از نظر فسفر و یا پروتئین با جیره دستی جبران كرد. از بین بردن لاشه حیوان به منظور جلوگیری ازآلودگی مراتع توصیه می شود. در مناطقی كه بیماری بومی است مایه كوبی با توكسوئید اختصاصی مفید می باشد.
تزریق یكبار توكسوئید ایمنی كافی پس از دو هفته در دام ایجاد می كند و تا 2 سال دوام دارد.
بررسی كلستریدیوم بوتولینوم رشد كرده در پلیت آگار زرده تخم مرغ جهت مثبت بودن تست لیپاز (در این تصویر Gaspak نیز كه در یك جار قرار كلستریدیوم
بوتولینوم تیپ A : رشد كرده در پلیت آگار خوندار پس از 72 ساعت(بزرگنمایی 5 برابر)
كلستریدیوم بوتولینوم تیپ A : رشد كرده در پلیت آگار خوندار ( Blood agar ) پس از 48 ساعت صویر كلستریدیوم بوتولینوم تیپ A رنگ آمیزی Gram شماره 2 تصویر كلستریدیوم بوتولینوم ( میكروسكوپ الكترونی ) صویر اسپورهای كلستریدیوم بوتولینوم در رنگ آمیزی Malachite Green شماره 1 كلستریدیوم بوتولینوم تیپ A رنگ آمیزی Gram كشت شده در محیط thioglycollate broth در دمای 35 درجه سانتیگراد پس از 48 ساعت وتولیسم زخم در دست یك پسر ۱۴ ساله وتولیسم نوزادان در یك نوزاد شش هفته ای

**CASSIATORA** · Jun-21-2008, 20:34

آسیت Asites :

آسیت Asites

مقدمه:

همراه شدن اکسیژن ناکافی با تهویه ضعیف و فیزیولوژی پرنده ( کم بودن ظرفیت حیاتی و یا خصوصیات نژادی) سبب ایجاد آسیت می شوند. آسیت یک بیماری است که در جوجه های گوشتی رخ می دهد و در سر تا سر جهان این بیماری وجود دارد اما این بیماری در مناطق مرتفع بسیار شایع تر است. این بیماری به علت یک سری مجموعه سبب شناسی رخ می دهد و با کاهش تهویه، افزایش ارتفاع و بیماری های تنفسی مستعد تر می شود. ایجاد بیماری 1 تا 5 درصد و مرگ و میر حاصل از آن 1 تا 2 درصد است ولی در مناطق مرتفع تا 30 درصد هم می رسد. عامل اصلی یجاد این بیماری تنگ شدن سرخرگ ریوی است.

نشانه های این بیماری:

مرگ ناگهانی که به صورت سریع گسترش پیدا می کند، رشد ضعیف، ضعف پیش رونده، باد کردگی محوطه بطنی (شکم)، خمودگی، دبرس تنفسی و یا شاید یرقان.

علائم کالبد گشایی:

ضخیم شدن عضله سمت راست قلب، آماس بطنی، ضخیم شدن دریچه ششی قلب، گرفتگی سیاهرگ اصلی، گرفتگی شدید عضلات، ششها و روده های متراکم، کبد بزرگ، طحال گوچک، حضور مایعات در محوطه بطنی، نشت از حفره پریکارد. علائم میکروسکوپیک شامل افزایش ندول های غضروفی در ریه.

تشخیص:

ضایعات مشخص پاتولوژیک، حضور پروتئین مخصوص قلب ( تروفونین T ) در خون که یکی از فاکتور های مشخص تشخیصی است، تفریق از دیگر سندرمهای مرگ ناگهانی و اندوکاردیت باکتریایی.

درمان:

افزایش تهویه، ویتامین C ، گزارش شده است که در امریکای شمالی از این ویتامین استفاده کرده اند و اثرات بسیاری از این ویتامین دیده اند.

پیش گیری:

تهویه مناسب (به خصوص در هنگام جوجه کشی و حمل و نقل جوجه ها)، اجتناب از خریداری کردن جوجه با پیش زمینه ارثی و کنترل بیماری های تنفسی.

**CASSIATORA** · Jun-21-2008, 20:41

Aspergillosisآسپرژیلوزیس

آسپرژیلوزیس

مقدمه:
این بیماری یک عفونت قارچی است که توسط آسپرژیلوس فومیگاتوس ایجاد می شود. بارز ترین نشانه این بیماری نفس نفس زدن بدون صدا است به خصوص در جوجه های کم سن. بعضی از اوقات ارگانیسم های دیگری هم باعث این گونه علائم می شوند و لی بیشتر در مرغ های بالغ تر و با جراحات چشمی و یا جراحات مزمن دیده می شود. قارچها می توانند همراه با مواد غذایی از کارخانه جات تولید این گونه مواد، در خیلی از گونه های جانوری همانند پرندگان و انسانها ایجاد بیماری کنند. گاهی اوقات جراحات همانندی با گونه های دیگر آسپرژیلوس و یا با قارچ های دیگر مثل پنی سیلیوم ها و یا آبسیدیا تولید می شود.

این قارچ در ماکیان، بوقلمون، اردک، پنگوئن، پرندگان زینتی، و پرندگانی که در آب زندگی می کنند، در سطح جهانی می تواند ایجاد بیماری می کند. دوره کومون این بیماری 2 تا 5 روز است، شیوع مریضی معمولا کم است ولی گاهی تا 12 درصد هم می رسد، مرگ و میر این بیماری حدود 5 تا 15 درصد است.

انتقال این بیماری با استنشاق اسپور زیاد قارچ در محیط صورت می پزیرد. معمولا انتقال از یک جوجه به جوجه دیگر خیلی کم صورت می گیرد. اسپور ها بسیار به مواد ضد عفونی کننده مقاوم هستند.

نشانه ها:

فرم حاد:

بی اشتیاقی، سستی، جیک جیک کردن بدون صدا، تنفس سریع، لاغری، خواب آلودگی، علائم عصبی (نادر).

فرم مزمن:

ترشحات از چشم ها (فقط ترشحات)، تحلیل رفتن بدن.

علائم کالبد گشایی:

ندول های زرد تا خاکستری یا پلاکهایی در ریه ها.
کیسه های هوایی، نای، پلاک هایی در محوطه صفاقی که شاید به سطحی متمایل به سبز داشته باشد.
ورم ملتحمه چشم، کراتیت.
ضایعات مغزی در جوجه هایی که علائم عصبی دارند.

تشخیص:

معمول ترین اساس تشخیص وجود نشانه ها و جراحات و آزمایشات میکروسکوپیک برای اثبات وجود قارچها در غذا می باشد که ترجیحا بعد از گوارش در هیدر اکسید پتاسیم 10 درصد است. تایید وجود قارچ ها با قرار دادن قسمتی از بافتهایی که تحت تاثیر قارچ قرار گرفته است در ژل سابوراید آگار برای کشت قارچ است. رشد قارچ در طی 24 تا 48 ساعت بعد رخ خواهد داد و کلونی هایی با منظره پودری و سبز- آبی ایجاد خواهد کرد.

بین عوارض آسپرژیلوس با در معرض بیش از اندازه بودن در برابر فرمالین یا واکنش در برابر واکسیناسیون در روز های گذشته و یا از استرس گرمایی در مرغ های مسن تر تفاوت وجود دارد.

درمان:

معمولا درمانی وجود ندارد. اسپری محیط با ضد قارج های موثر غیر مسمومیت زا، ممکن است به کاهش درگیری کمک کند. آمفوتریسین B و نیستاتین در پرندگان زینتی به کار برده می شود.

پیش گیری:

یستر خشک و با کیفیت، غذای بهداشتی، رعایت کردن بهداشت محیط، استفاده از تیابندازول و یا نیستاتین در غذا.

**CASSIATORA** · Jun-21-2008, 20:52

بیماری آنفولانزای طیور (قسمت اول)

تاریخچه :

این بیماری كه سبب مرگ ومیر بالایی در پرندگان عفونی می شود برای اولین بار در سال 1878 ،بیش از صد سال پیش در ایتالیا شناخته شد (1) . تا اوائل سال 1901 نشان داده شد كه میکروارگانیسم عامل این بیماری یك ویروس می باشد اما هنوز تا سال 1955 ارتباط بین این بیماری و دیگر ویروسهای ملایم جدا شده از پرندگان با ویروسهای آنفولانزایA پستانداران مشخص نشده بود(برای اولین باردردهه930 ) .
آنفولانزای مرغی در ایالت متحده در سال 25 ـ 1924 شایع شد و در سال 1929 دوباره این شیوع رخ داد در حالی كه هر دوبار ریشه كن شد .
یك پاندمی بزرگ از آنفولانزای مرغی بسیار پاتوژن در شمال شرقی ایالت متحده در سال 84 ـ 1983 رخ داد . بیش از دو سال وقت و70 میلیون دلار هزینه برای ریشه كنی آن صرف گردید و بطور تخمینی 17میلیون پرنده طی برنامه ریشه كنی معدوم شدند .

فقط ویروسهای آنفولانزای تیپ A بعنوان عوامل طبیعی عفونت زائی در پرندگان شناخته شده بودند در حالی كه 9 تحت تیپ NA و15 تحت تیپ HA از آنفولانزای تیپA كه به احتمال خیلی زیاد به صورت تركیبی با هم می باشند از گونه های مختلف پرندگان جدا شده اند .
ایالت متحده هیچ شیوع وسیعی از سال 1986 نداشته است اگر چه سویه های كم پاتوژن در حال حاضر وجود دارند وخسارات قابل توجه ای نیزبه بارمی آوردند.
در سال 97 ـ 1996 تعدادی از مزرعه های تخم گذار در مناطق لبانون و لنكستر تیتر PA آنها برای آنفولانزای مرغی H7N2 مثبت شد . این سویه برای جوجه ها غیر بیماری زا بود ولی دارای اثرات وسیع مخرب برروی صنعت طیور بود .
در سال 1994 یك شیوع آنفولانزای مرغی در مكزیك رخ داد كه به صورت ملایم و خفیف شروع شد اما در اثر موتاسیون به یك ویروس كشنده تبدیل شد وسبب تلفات سنگینی در گله طیور گوشتی گشت .
یك سناریوی مشابه در شمال شرقی ایالت متحده در اواسط 1980 رخ داد .
سرو تایپ بسیار پاتوژنی كه سبب شیوع در سالهای 84 ـ 1983 در ایالت متحده و مكزیك گردید H5N2 نام داشت .
از نظر تاریخی ، سروتایپهای H5 و H7 با بیماری های با حدت بالا در طیور همراه هستند .

پرندگان وحشی :

اولین جداسازی ویروس آنفولانزاازپرندگان شكاری درسال1961 از پرستوهای معمولی (stema hirundo)
در جنوب آفریقا صورت گرفت ، اما تا اواسط دهه1970 هیچ گونه تحقیق سیستماتیكی برروی آنفولانزا در پرندگان شكاری انجام نگرفت بود . شواهد نشان می دهند كه مخازن مهم ویروسهای آنفولانزا پرندگان شكاری می باشند و ویروس می تواند در این جمعیت ها پایدار بماند .

پرندگان قفسی :

از سال 1975 زمانی كه اولین جداسازی از پرندگان قفسی به ثبت رسید مشخص شد كه تمامی نمونه های جداشده از پرندگان قفسی بطور عمده از تحت تیپ H3 و H4
می باشند .
ویروسهای آنفولانزای مرغی بطور عمده از گونه های گنجشكیان جدا
می شوند و به ندرت گونه های طوطی سانان (psittacin) را درگیر می سازند .
گر چه در صورت وجود ویروسهای آنفولانزا در پرندگان یك منطقه موقع خروج آن از كشور حتی تا سالها بعد ازجدا نشدن ویروس ازآن منطقه پرندگان رادرقرنطینه برای مدت دوره كمون تحت مراقبت نگه می دارند.
مثالهای تأئیدشده ای از عفونت های انسانی با ویروسهای آنفولانزا از سال 1997:

1997 : در هنگ كنگ ، آنفولانزای مرغی تیپA (H5N1) هم جوجه ها هم انسانها را عفونی ساخت ، این اولین باری بود كه ویروس آنفولانزای مرغی مستقیماُ از پرندگان به انسان منتقل می شد .
طی این شیوع 18 نفر بستری شدند و 6 نفر از آنها از بین رفتند . برای كنترل شیوع مسئولین تقریباُ 5/1 میلیون جوجه را از بین بردند برای اینكه مخزن ویروس را از بین ببرند. دانشمندان نشان دادند كه ویروس ها ابتدا از طریق پرندگان در میان انسانها شایع شدند وانتقال شخص به شخص كمتر مورد توجه می باشد .

احتمال پاندمیك شدن یك آنفولانزای مرغی :

تمامی ویروسهای آنفولانزا توانایی تغییر را به طور بالقوه دارا می باشند . این مسئله احتمال دارد كه ویروس آنفولانزای مرغی تغییر پیدا كند و توانایی آلوده ساختن انسان را پیدا كند و براحتی از شخص به شخص منتقل شود . بدلیل اینكه این ویروسها به طور معمول انسانها را عفونی نمی سازند باعث شده كه در میان جمعیت انسانی هیچ مصونیتی یا به میزان خیلی كمی مصونیت در برابر آنها وجود داشته باشد . اگر یك ویروس آنفولانزای مرغی قادر باشد انسانها را آلوده سازد وبراحتی از شخص به شخص منتقل شود یك پاندمی آنفولانزا می تواند پیش آید . پاندمی های گذشته آنفولانزا سبب مرگ ومیر وخسارات اقتصادی بالایی شده اند .

در قرن بیستم 3 پاندمی رخ داده است :

1-1919 ـ 1918 : آنفولانزای اسپانیایی : A(H1N1) ، سبب بالاترین مرگ ومیر شده بیش از 500000 نفر در ایالت متحده و 20 تا 50 میلیون نفر احتمالاُ در تمام دنیا از بین رفتند . تعداد زیادی در همان روز اول بعد از عفونت وبقیه از عوارضی كه خیلی زود ظاهر می شدند در گذشتند . تقریباُ نیمی از آنها جوان و بالغین سالم بودند .
2-1958 ـ1957 : آنفولانزای آسیایی : A(H2N2) سبب حدود 70000 مرگ ومیر در ایالت متحده شده است . اولین بار در كشور چین در اواخر فوریه 1957 شناسایی شد وآنفولانزای آسیایی تا ژوئن 1957 در ایالت متحده منتشر شد .
3-1969 ـ 1968 : آنفولانزای هنگ كنگی : A(H3N3) سبب به طور تخمینی 34000 مورد مرگ ومیر در ایالت متحده گردید . این ویروس اولین بار در هنگ كنگ در اوائل 1968 شناسایی شد وتا اواخر سال به ایالت متحده سرایت كرد . تیپ A(H3N3) هنوز تا امروز نیز در چرخش است . وقتی كه یك پاندمی آنفولانزای ویروسی پدید می آید آن ویروس در میان جمعیت های انسانی مستقر می گردد و برای سالها به چرخه زندگی خود ادامه می دهد . مركز كنترل بیماری های US و سازمان بهداشت جهانی دارای برنامه های وسیعی برای نشان دادن میزان فعالیت آنفولانزا در تمام دنیا می باشند كه شامل رسیدگی سریع به سویه های ویروسی كه احتمال پاندمیك شدن آنها وجود دارد می باشد .

دیگر مثالهای تأئید شده از عفونت آنفولانزای مرغی در انسانها :

1999 : در هنگ كنگ ، مواردی از آنفولانزای مرغی A تیپ (H9N2) در دو كودك تأئید شد كه هر دو بیمار بهبود یافتند و موارد دیگری تأئید نشد . شواهد دال بر این است كه طیور منبع عفونت بودند و راه اصلی انتقال از پرنده به انسان بوده است . اما احتمال انتقال فرد به فرد نیز هنوز باقی می ماند . موارد دیگری از عفونت با H9N2 از mailand چین در طول سالهای 1998 تا 1999 گزارش شد .

2003: آنفولانزای مرغی تیپ A (H7N7) در میان كارگران مرغداری وخانواده هایشان در نیدرلند طی شیوع آنفولانزا در مرغداری ها شایع شده بیش از 80 مورد بیماری گزارش گردید ، (علائم به صورت عفونت چشمی به همراه علائم تنفسی بود) و یك بیمار از بین رفت . شواهدی نیز ازانتقال فرد به فرد وجود داشت .
2003 : عفونتH9N2 در یك كودك در هنگ كنگ تأئید گردید . كودك بستری شد اما بهبود یافت . همچنین ویروسهای آنفولانزا كه مسئول پاندمیك های 1957 و 1968 بودند بوسیله نوتركیبی ژنتیكی بین انسان و ویروسهای مرغی پدید آمدند .

همزمان با اولین گزارش انتقال داخل گونه ای ویروسهای خوكی به انسان در سال 1974 ، موارد اسپورادیك آن از انسان جدا شد و بیشترین میزان عفونت در سربازان عفونی در اپیدمی fort dix در ایالت متحده در سال 1976 گزارش شد .
متعاقباُ ، ویروسهای نوتركیب آنفولانزای خوكی به نام ویروس آنفولانزای مرغی ـ انسانی A H3N2 نشان داده شد كه مسئول دو مورد آنفولانزا در بچه های كم سن و سال در netherland در سال 1993 بود . این ویروسهای نوتركیب دارای ژنهای شبه مرغی بودند كه پروتئین های داخلی را كد می كردند و ژنهای شبه انسانی HA و NA را داشتند .

مقدمه :
ویروسهای تیپ A آنفولانزا می توانند تعدادی از رده های حیوانی را شامل : پرندگان، خوكها ، اسبها ، فك و والها را عفونی سازند . ویروسهای آنفولانزائی كه پرندگان راعفونی می سازند ویروسهای آنفولانزای مرغی نامیده می شوند.پرندگان بخصوص دارای اهمیت ویژه ای هستند به دلیل اینكه تمامی تحت تیپهای آنفولانزایA در میان پرندگان وحشی كه میزبانهای طبیعی و با اهمیت و مورد توجه این ویروسها
می باشند در چرخه اند .
آنفولانزای مرغی بطور معمول مستقیماُ انسانها را عفونی نمی سازند یا اینكه دارای چرخه زندگی در میان انسانها نمی باشند .
آنها را می توان بر اساس قدرت بیماریزائیشان به دو گروه مجزا دسته بندی كرد . ویروسهای بسیارپاتوژن مسبب طاعون پرندگان كه امروزه بخش ویروسهای آنفولانزای بسیار پاتوژن را تشكیل می دهند (HPAT) كه در آن میزان مرگ ومیر ممكن است تا 100% برسد . این ویروسها به تحت تیپهای H5 و H7 محدود می شوند اگر چه تمامی ویروسهای این تحت تیپها سبب HPAI نمی شوند . تمام ویروسهای باقی مانده باعث بروز بیماری ملایم و ابتدائی تنفسی می شوند كه ممكن است بوسیله دیگر عفونتها یا وضعیت های محیطی تشدید گردد .(7 )
ویروسهای آنفولانزا تیپ A بر اساس پروتئین های سطحی شان یعنی هماگلوتینین (HA) و نورآمینیداز (NA) تقسیم بندی می شوند . تعداد 15 تا تحت تیپ HA و 9 تا تحت تیپ NA وجود دارد . تمامی گروهها می توانند در پرندگان یافت شوند ولی فقط 3 زیرگروه از HA ) H1وH2 وH3 ( و دو زیر گروه از NA (N1 N2) دارای چرخه زندگی در میان انسانها هستند . (1 )
آنفولانزای مرغی معمولاُ پرندگان وحشی را بیمار نمی سازد ولی می تواند پرندگان اهلی را شدیداُ بیمار ساخته وآنها را بكشد . بطور معمول انسانها را عفونی نمی سازند لیكن تعدادی از مثالهای عفونتهای انسانی و شیوع در میان آنها از سال 1997 گزارش شده است .
هنگامی كه چنین عفونتهایی رخ می دهد مسئولین بهداشت جهانی نشان داده اند كه وضعیت و نشانه های بالینی بیماری به آنفولانزای مرغی نزدیك می باشد و این می تواند بطور بالقوه باعث انتشار وسیع عفونت در میان انسانها گردد .
امروزه قوانین وسیع حفظ امنیت زیستی از انتشار ویروس به ایالت متحده و كشورهای همسایه جلوگیری می كند . تلاشهای محققان مستقیماُ برروی اینكه چگونه و چرا ویروسهای پاتوژن تبدیل به ویروسهای بسیار پاتوژن و خطرناك می شوند متمركز می باشد
این ویروسها دارای RNA ,envelop تك رشته ای منفی كه به تایپهای A وB وC طبقه بندی می شوند هستند
ژنوم ویروس آنفولانزای A شامل 8قطعه RNA تك رشته ای می باشد كه حداقل 10محصول ژنی راكد می كند .
ماهیت سگمنته ژنوم باعث نوتركیبی ژنها هنگامی كه سویه های مختلف یك میزبان راعفونی می سازد می شود.
نوتركیبی ژنتیكی ، كه منجر به تولید تغییرات آنتی ژنیك در انسانها می شود به عنوان شیفت آنتی ژنیك شناخته می شود . تعدادی از چنین شیفتهای آنتی ژنی تاكنون رخ داده است . برای مثال ، پاندمی وخیم آنفولانزا در 1918 و 1920 بدنبال خود شروع یك عفونت ویروسی در انسانها را با یك ویروس شبه مرغی به نام H1N1 به همراه داشت و مثالهای دیگر كه در تاریخچه ذكر شده است .
انتقال ویروسهای كاملاُ مرغی بطور مستقیم ، بدون هیچ میزبان واسطی مانند خوك تصور می شود كه بوسیله رسپتورهای اختصاصی سلولهای انسانی تعیین گردد . لیكن ، عفونت انسانها با ویروسهای آنفولانزای A مرغی امروزه مستند و ثابت شده است .
مثلاُ تمامی 8 قطعه ژنوم ویروس H5N1 جدا شده از انسانها در سال 1997 منشأ مرغی داشتند و 8 قطعه ژنوم H9N2 جدا شده در سال 1999 نیز مرغی بودند كه 6 قطعه ژنی آن كه تركیبات داخلی را كد می كردند مشابه آنهایی بودند كه در سال 1997 در ویروس H5N1 جدا شده از انسان و مرغ مشاهده شده بودند .
اگر چه این گونه انتقال های بین گونه ای غیر معمول می باشد اما كاملاُ مشخص شده كه برای شناسایی زود بهنگام میكروارگانیسم مسئول بیماری ضروری می باشد . تشخیص سریع و تعیین خصوصیت ویروسهای آنفولانزا برای مقایسه واریانتهای جدید با سویه هایی كه اخیراُ در چرخش می باشند و نیز با سویه های واكسن ضروری می باشد .
برای این هدف ، ویروسهای آنفولانزایی كه در آزمایشگاههای تشخیصی جدا می شوند
بطور روتین برای بررسی ژنتیكی و آنتی ژنیكی به آزمایشگاه رفرنس فرستاده می شوند .
گلیكوپروتئین هماگلوتینین ویروس آنفولانزا بعنوان یك پیش ساز تولید می شود (HAO) كه نیاز به شكستن بعد از ترجمه توسط پروته آزهای میزبان جهت فعال شدنش دارد . پروتئین های HAO پیش ساز دسته كم پاتوژن آنفولانزای مرغی دارای یك اسید آمینه آرژنین در محل برش می باشند و فقط توسط پروته آزهای میزبان مانند آنزیم شبه تریپسین محدود می شوند بنابراین به همانند سازی در محل هایی از بدن كه این آنزیمها یافت می شوند محدود میگردد ، مثل دستگاه تنفسی و روده ای . ویروسهای HPAI دارای اساس چند آمینواسیدی (آرژنین و لیزین ) در محلهای برش HAO هستند و بوسیله آنزیم منحصر بفرد پروته آزی این ویروسها قادر هستند در میان پرندگان همانند سازی كنند به ارگانهای حیاتی و بافتها آسیب برسانند كه منجر به بیماری و مرگ می شوند .

مشخصات آنفولانزای مرغی در پرندگان :

بطور عمده پرندگان آبزی بعنوان میزبانهای اصلی این ویروسها را در روده و ترشحات آن دارا می باشند . طیور آلوده ویروس را از طریق بزاق ، ترشحات بینی و مدفوعشان دفع ژمی كنند . آنفولانزای مرغی در میان پرندگان مستعد هنگامی كه آنها با ترشحات پرندگان آلوده تماس پیدا می كنند منتشر می شود اما در هر حال انتقال دهانی ـ مدفوعی شایع ترین مدل انتشار می باشد .
بیشتر ویروسهای آنفولانزا باعث بروز علائمی در پرندگان وحشی نمی شود یا اینكه فقط علائم خفیفی ایجاد می كنند . البته میزان بروز علائم درانواع پرندگان بسیار متفاوت می باشد وبستگی به سویه ویروس و نوع پرنده دارد. عفونت با ویروسهای اصلی آنفولانزای A ( برای مثال تعدادی از سویه های H5 وH7 ) می تواند باعث شیوع گسترده بیماری ومرگ ومیر در میان تعدادی از پرندگان وحشی و بخصوص پرندگان اهلی مانند جوجه ها و بوقلمون می شود.

علائم آنفولانزای مرغی در انسان :

علائم گزارش شده دارای طیفی از علائم آنفولانزای تیپیك (برای مثال تب ، سرفه ، گلودرد ودرد ماهیچه ) تا علائم چشمی ، پنومونیا ، اختلالات حاد تنفسی ، پنومونیا ویروسی ، و دیگر عوارض تهدید كننده سلامت می باشد .

انتقال :

پرنده آلوده ویروس را در مدفوع و ترشحات مجرای بینی دفع می كند . تصور
می شود كه گله های بهبود یافته نیز ویروس را البته به میزان كمتری نسبت به گله های با بیماری حاد دفع كنند .
مرغ های وحشی واهلی جزء اولین مخازن ویروسهای آنفولانزا هستند . مرغابی وحشی معمولاُ علائم كلینیكی را نشان نمی دهد ولی می تواند برای مدت طولانی ویروس را حمل كند . بعلاوه ، مرغابی می تواند با بیش ازیك نوع ویروس عفونی گردد . تعیین تایپها با این مشكل همراه است كه آنتی بادی قابل جداسازی در خون این پرندگان بعد از در معرض قرار گرفتن یافت نمی گردد . ویروس آنفولانزای موجود در آب و مواد معدنی ,آلی ، دریاچه ها و استخرها توسط مرغابی های عفونی دوباره وارد چرخه می شود . مخلوط شدن این پرندگان با مرغابی های پرورشی یكی از فاكتورهای دخیل در بروز تعدادی از همه گیری ها می باشد .
ویروس آنفولانزای مرغی می تواند برای مدتهای طولانی در دماهای معتدل زنده باقی بماند. ودر موارد فریز شده نیز برای مدت نامحدود زنده باقی می ماند .

بنابراین بیماری می تواند از طریق دفع غلط اجساد وكود ویا دیگر محصولات طیور منتشر گردد .
همچنین این بیماری می تواند براحتی توسط مردم و وسایل آلوده به ویروس آنفولانزا منتشر گردد . این ویروس می تواند برروی كفش های آلوده ، لباسها ، صندوق ، كارتن های تخم مرغ ، حاملین ودیگر تجهیزات انتقال پیدا كند.تمام محل های مزرعه طیور آلوده بایستی مورد توجه قرار گیرند وبطور كامل تمیز وضد عفونی شوند ، قبل از اینكه مجوز انتقال به آنها داده شود لباسهایی كه در مزرعه آلوده پوشیده شده باید حتماُ شسته شوند .
حشرات وجوندگان ممكن است بطور مكانیكی ویروس را از پرندگان آلوده به پرندگان مستعد حمل كنند . ویروس آنفولانزای مرغی از تخم های اردك جدا شده است و این مسئله احتمال انتقال عمودی یا vertical را مطرح می سازد اگرچه بطورتیپیك ویروس جنین تخم مرغ رامی کشد . شواهد كم و ناچیزی ازعفونت جوجه با منشأتخم در دست می باشد . ولی سطح پوسته تخم مرغها می تواند با ویروس آلوده شود در نتیجه یك راه انتقال محسوب می شود .
ویروس آنفولانزای مرغی بكرات از پرندگان وارداتی سالم جداشده است . این پرندگان آلوده یك خطر بالقوه برای پرندگان قفسی ، وحشی و گله های طیور پرورشی محسوب می شوند . مغازه های فروش پرندگان زنده یك مخزن عفونت می باشند . این مغازه ها اغلب انواع پرندگان خانگی و زینتی را می فروشند و به ندرت این محل ها تمیز یا ضد عفونی می شوند .
این سیستم كه انواع مختلف طیور استرس دیده را با هم مخلوط می سازد یك عامل كلیدی در شیوع آنفولانزا در تجارت طیور می باشد .
صاحبان مرغداریها خود اولین خط دفاعی برای شناسایی شیوع آنفولانزای مرغی هستند . اگر پرندگان در نشان دادن علائم آنفولانزای مرغی پیشرفت كردند بایستی بلافاصله به سازمانهای مسئول اطلاع دهند .

پیشگیری :
برنامه واكسیناسیون ، مراقبت سخت در طول مدت دوره چهل روزه پرورش طیور برای كنترل فرمهای خفیف بیماری در گله های مرغی و اردكها مورد استفاده قرار می گیرد .
اما در مورد بیماری های كشنده تر مراقبت سخت درطول دوره وجداسازی جوجه های آلوده تنها روش مؤثر در متوقف كردن آنفولانزای مرغی می باشد.
موفقیت در چنین برنامه هایی بستگی به همكاری كامل و حمایت دولت از صنعت طیور دارد .
با شناخت این مسئله كه مخزن آنفولانزای مرغی مرغابی های وحشی می باشند هر كوششی باید بر اساس جلوگیری از تماس مستقیم و غیرمستقیم بین پرندگان خانگی و مرغابی های وحشی طرح ریزی گردد .

WHO (سازمان بهداشت جهانی) و مدیریت عفونتهای انسانی از طریق كنترل آنفولانزای A(H5N1)
این راهنمایی ها بر اساس اطلاعات موجود از عفونتهای آنفولانزای انسانی A (H5N1) كه از تجربیات بدست آمده از شیوع 1997 در هنگ كنگ یك منطقه اختصاصی اداری از چین و از گزارشات اولیه از موارد اخیر در تایلند و ویتنام استخراج شده است . همانطور كه اطلاعات بیشتر بدست می آید این راهنمایی ها نیز بطور مناسب تغییر پیدا می كند .

توجه :

مفهوم اولیه كنترل عفونت رعایت احتیاط برای به حداقل رساندن انتشار تنفسی بیماری می باشد .
مدیریت مناسب برای پیشگیری از بیماری حاد ومرگ ومیر
شناسایی زود هنگام و دنبال كردن افرادی كه در رسیك ابتلاء هستند . به منظور درمان آنها با داروهای ضد ویروسی برای كاهش میزان مرگ ومیرو انتشار بعدی بیماری .

هشدارهای عمومی :

كنترل عفونت موجود شامل به كار بردن احتیاط های استاندارد برای تمام بیمارانی كه به بیمارستان مراجعه می كنند می باشد .
اگر كه تشخیص آنفولانزای A (H5N1) بر اساس علائم بالینی داده شود بایستی احتیاطهای اضافی تا موقعی كه تشخیص رد شود رعایت گردد .
در آن كشور ها وسرزمین هایی كه ویروس های آنفولانزای A(H5N1) بعنوان یك عامل بیماری زائی در جمعیت های حیوانی شناسایی شده است ، تشخیص آنفولانزای H5N1 بایستی با دیگر بیماریهای حاد تنفسی تمایز داده شود . اشخاصی كه هم با طیور بیمار وهم با طیوری كه از بیماری تلف شده اند در تماس هستند در معرض ریسك ابتلای بیشتری هستند .
كشور ها یا سرزمین هایی كه بطور تجربی با شیوع آنفولانزای مرغی با بیماریزایی بالا مواجه هستند بایستی افرادی كه در بخش بهداشت و پزشكی كار می كنند با واكسن فصلی نو تركیب سازمان بهداشت جهانی واكسینه شوند . بطور منطقی این موضوع سبب كاهش فرصت ایجاد عفونت در انسانها توسط ویروس آنفولانزای مرغی می شود ولی درعوض،فرصتی را برای بازآرائی وظهورآنفولانزای جدید با قدرت جهانی شدن پدید
می آورد.

- كنترل عفونت و پیشگیری از انتشار تنفسی آنفولانزای :A (H5N1)

انتقال آنفولانزای انسانی بوسیله قطرات و ذرات منتشر در هوا صورت می گیرد . انتقال توسط تماس مستقیم و غیر مستقیم نیز شناسایی گردیده است . لیكن در طول سال 1997 آنفولانزای A (H5N1) در انسانهادر SAR هنگ كنگ ، رعایت احتیاط های مربوط به انتشار قطرات و تماس مستقیم بطور موفقیت آمیز از انتشار بیماری جلوگیری كرد .
بدلیل درصد بالای مرگ ومیر بیماری و احتمال موتاسیون ویروس كه باعث انتقال فرد به فرد شود سازمان بهداشت جهانی استفاده از ماسكهای بسیار مؤثر به منظور رعایت احتیاط هنگام تماس و برخورد با قطرات معلق توصیه كرد . بعلاوه اگر كه یك اطاق با فشار منفی در دسترس باشد بهتر می باشد .
ایزوله كردن بیمار در یك اتاق ، اگر كه یك اتاق جداگانه در دسترس نباشد بیماران بایستی به طور جداگانه در یك بخش یا اتاق مجزا بستری شوند . تختها بایستی یك متر با هم فاصله داشته باشد و بهتر است كه تختها بوسیله یك سد فیزیكی مثل پارتیشن از هم مجزا گردند .

مناسبترین روش برای محافظت اشخاصی كه وارد اتاق می شوند استفاده ازگان ، ماسكهای بسیار قوی ، محافظ صورت یا عینك و دستكش می باشد . تعدادمحدودی از كاركنان سازمان بهداشت جهانی (HCW) كه دارای تماس مستقیم با بیماران بودند نبایستی با بیماران دیگر برخورد كنند .
تعداد دیگری از كارمندان بیمارستان (مانند نظافت چی ها و پرسنل آزمایشگاه) كه با محیط این بیماران در تماس هستند همچنین بایستی محدود گردند .

بایستی از HCW ها (پرسنل بیمارستان ) كه در تماس با بیماران هستند خواسته شود كه روزانه دوبار دمای بدنشان راچك كنند وهرگونه تبی را به مسئولین بیمارستان گزارش دهند . یك HCW كه دارای تب بالای 37c است و در تماس مستقیم با بیماران بوده است بلافاصله بایستی درمان شود .
راهكارهای پیشگیرانه بعد از در معرض قرار گرفتن (برای مثال: داروهای خوراكی oseltamivir به میزان روزانه 7mg برای 7روز) برای پرسنل بیمارستانی كه احتمال تماس با ترشحات افراد بیمار برایشان وجود دارد توصیه می شود HCW هایی كه حال عمومی خوبی ندارند نبایستی با بیماران در تماس مستقیم باشند چرا كه آنها آسیب پذیر هستند و ممكن است كه وقتی كه در معرض ویروس H5N1 قرار گیرند بیماری حاد تری را روی كاربیاورند .

**CASSIATORA** · Jun-21-2008, 20:59

بیماری آنفولانزای طیور (قسمت دوم)

مدیریت بیماران :
گرفتن نمونه خون ودستگاه تنفس و ارسال به آزمایشگاه برای تست آنفولانزا و دیگر عفونتهایی كه علائم بالینی مشترك دارند .
درمان با اینهیبیتور نورآمینیدازها مانند oseltamivir (بصورت 75mg خوراكی ، دوبار در روز) بعنوان اولین مراحل درمان بكار میرود .
اگر كه علائم بالینی ظاهرشد بیمار بایستی در بخشی كه قبلاُ توضیح داده شد برای كنترل عفونت بستری گردد.
اگر كه تشخیص داده شد بیمار نیاز به بستری شدن ندارد بایستی به بیمار وخانواده اش ضوابط بهداشت فردی و كنترل عفونت (برای مثال: شستن دستها، استفاده از ماسك كاغذی یا جراحی برای شخص بیمار وپرهیز از تماس جمعی) آموزش داده شود اگر كه نیاز دارد توسط دارو تحت درمان حمایتی قرار گیرد همچنین بیمار با پزشك معالج توسط تلفن ویا ویزیت شدن در تماس باشد .درمانهای حمایتی شامل مراقبت از اشباع بودن اكسیژن واستفاده از ذخیره اكسیژن در صورت كم شدن اكسیژن ماسكهای اكسیژن nebulizer ویا high-air-flowدر سندرم عفونت حاد تنفسی برای پیشگیری از انتشار تنفسی بكار می رود .

این توصیه ها فقط هنگامی كه بیماری شدید باشد و كنترل آن مشكل می باشد مورد نیاز هستند .
گرفتن نمونه های خون وتنفسی بطور مرتب برای چك كردن عفونتهای باكتریایی احتمالی مورد نیاز می باشد . استفاده از درمان آنتی بیوتیكی به صورت تزریقی را نیز باید در نظر داشت . از آمانتیدین یا ریمانتیدین استفاده نكنید بدلیل خطر افزایش موتاسیون انتخابی در جهت مقاومت ویروسی با توانایی جهانی شدن . نتایج اولیه كه توسط مراكز مختلف بهداشت جهانی بدست آمده پیشنهاد می كند كه ویروس آنفولانزای A (H5N1) كه اخیراُ از انسانها جدا شده اند نسبت به آمانتیدین وریمانتیدین مقاوم می باشند .
پرهیز از تجویز سالیسیلاتها (مانند آسپیرین) در بچه های زیر 18سال بدلیل ریسك سندرم reye .
استفاده از paracetamol یا ibuprofen با هم بصورت خوراكی یا شیافت برای كنترل تب.

تعدیل كنندهای سیستم ایمنی مانند كورتیكواستروئیدها بایستی فقط به موازات عملیات كلینیكی صورت گیرد. پاسخ ایمنی انسان در مقابل آنفولانزای A (H5N1) هنوز نیاز به مطالعات بیشتری دارد .
از ribavirin استفاده نكنید. هیچگونه شواهدی دال بر مؤثر بودن این دارو بر علیه آنفولانزا وجود ندارد در عوض عوارض ناخواسته مانند آنمی شایع می باشد و ممكن است كه بیمار را بیشتر به مخاطره بیاندازد .
برای فهم بهتر الگوی دفع ویروس در انسانهای عفونی شده با ویروسها A (H5N1) در شیوع آنفولانزا در تایلند وویتنام نیاز به مطالعات بیشتری می باشد . تا اینكه شواهد دیگری به دست آید در حال حاضر WHO توصیه كرده است كه ضوابط كنترل عفونت تا 7روز بعد از قطع تب ادامه پیدا كند .
مطالعات قبلی برروی آنفولانزا براین امر كه كودكان باسن كمتراز 12سال می توانند برای 21روز پس از شروع بیماری ویروس را دفع كنند می باشد . بنابراین ، برای كنترل عفونت بهتر است كه كودكان برای این دوره در محل مراقبت باقی بمانند . كودكان در این مدت نبایستی به مدرسه بروند .
افرادی كه بااین بیماران در تماس مستقیم بوده اند بلیستی برای 7روز تحت نظر قرار گرفته شوند ودمای بدن آنها دوبار در روز چك شود اگر كه فردی تب بالاتر از 38c و سرفه یا تنگی نفس را نشان داد بایستی بلافاصله درمان شود .
آنفولانزای مرغی جدید در دانمارك،10000 اردك را ازبین برد .
ویروس A H5N1 در اردكها شناسایی شد .

یك نوع جدید ویروس A آنفولانزا ،H5N1 ، برای اولین بار در اردكهای دانماركی شناسایی شد . بدنبال ظهور بیماری بین 12000 اردك . در یك مزرعه اردك نزدیك به شهر salling در jutland دو ویروس شناسایی شدند: یك ویروس عامل Entritis در اردك (DVE) ،كه عامل بیماری بود ویك ویروس آنفولانزای A .
تمامی اردكها بطور خیلی وسیعی در 10 سپتامبر 2003 درگیر بیماری شدند . ویروس آنفولانزایA از بافت تعدادی از اردكها جدا شد . انستیوسرم سازی statens از RT – PCRطول كامل هماگلوتینین ونورآمینیداز با تعیین توالی روتین كه ترجیحاُ بطور مستقیم برروی نمونه ها انجام می گیرد تا برروی ویروسهای كشت داده شده استفاده كردند و ژنوتیپ این ویروس را H5N7 نام نهادند .

این تایپ قبلاُ هیچ گاه شناسایی نشده بود وبررسی های بیشتر هم اكنون برروی آن در حال انجام است . نكته با اهمیت اینكه این ویروس در انسانها تشخیص داده نشده بخصوص در میان افرادی كه با این اردكها تماس داشتند یا در تعدادی موارد غیر مرتبط ویروس آنفولانزای (H3N2) A در دانمارك از 1 سپتامبر 2003 تشخیص داده شد .12 سویه ویروس آنفولانزای مرغی (AIV) A از پرندگان وحشی در دانمارك از 1996 جدا شد كه هیچ كدام از آنها H5 یا H7 نبود .
پرندگان وحشی مخزن طبیعی آنفولانزای مرغی هستند (AIV) . اگر چه ویروسهای كم پاتوژن H5 وH7 وجود دارد ولی تمامی ویروسها با بیماری زایی بالا یا H5 یا H7 هستند . پاتوژنسیته ویروسهای AIV H7 و H5 حداقل تا قسمتی وابسته به توالی آمینو اسیدی در محل برش در HA1/HA2 دارد. چنین توالی های پاتوژنیكی یافت نشدند . بنابراین این سویه AIV در گروه ویروسهای باپاتوژنسیته پائین قرار گرفت . توانایی تغییر پاتوژنسیته مثلاُ طی تكثیر در پرندگان یا نوتركیبی در خوكها ویا انسانها شناسایی نشده است . ویروسهای بسیار پاتوژن AIV از تیپ H5 و N7 اغلب انسانها را درگیر می سازند . این مسئله در سال 1997 در هنگ كنگ رخ داد (H5N1) كه 6 نفر از 18 فرد آلوده شده از بین رفتند ودوباره در سال 2003 كه یكی از دو فرد آلوده شده مردند ودر سال 2003 در Netherland سویه H7N7 شایع شد كه 1 نفر از هر 80 بیمار از بین رفتند . سازمان بهداشت جهانی تصویب كرد تمامی كشورها كمیته های بین المللی در مورد مدیریت اپیدمی های آنفولانزا تشكیل گردد .
شبكه های آزمایشگاهی نظارتی و روشهای ژنوتایپ كردن بایستی با كارهای این كمیته های بین المللی هماهنگ شود .
ویروسهای آنفولانزای مرغی عوامل مشترك بین انسان وحیوان می باشند كه بعنوان یك خطر مداوم سلامت جمعیت های انسانی وحیوانی را تهدید می كند . طی 6 سال گذشته، عفونت انسانها با ویروسهای آنفولانزای مرغی از 3 تحت تیپ (H5, H7, H9) بكرات تشخیص داده شده است .
ویروس آنفولانزای مرغی H7N7 كه سبب آنفولانزای شدید در 225 مزرعه طیور در هلند در سال 2003 شد همراه با عفونت ملتحمه چشم (conjunctivitis) در 347 انسان بود . عفونت با ویروس H7N7 در 87 مورد، مورد تأئید قرار گرفت ، یك نفر دامپزشك در اثر عفونت جان سپرد . شواهدی از انتقال فرد به فرد ویروس و ایجاد عفونت درخوكها دردست می باشد . این شیوع بوسیله جداكردن وقرنطینه كردن طیور عفونی كنترل شد . برای جلوگیری از پدید آمدن وانتشار ویروس نوترتیب مرغی ـ انسانی كارگران مرغداریها بوسیله واكسن آنفولانزای انسانی واكسینه شدند وداروی آنتی نورآمینیداز به آنها داده شد .
انتقال آنفولانزای مرغی H5N1 به انسانها در سال 1997 ثابت كرد كه این ویروس علی رغم اینكه ترجیح می دهدبارسپتورهای سیالیك اسیدمرغی باند شوند توانایی انتقال به انسان رادارد (برای مثال آنهابایك gal 3 و2 × انتهایی لینك می شوند .)
قبل از 1997، گزارشاتی از عفونتهای انسانی باH7N7 وجود داشت (معمولاُ باعث عفونت ملتحمه می شد) ، اما شواهد محكمی دال بر انتقال مكرر ویروسهای مرغی به انسانها دردست نبود . چگونه ویروسهای آنفولانزای مرغی در ایجاد عفونت در پستانداران به طور تصاعدی قوی تر شده اند؟ (متن در مقاله 8)

مقاله شماره (4) :
ارزیابی تلفیق PCR با MOBILITY هترودوبلكس برای تعیین و تشخیص ویروسهای آنفولانزای A از انواع حیوانات :
خلاصه :
انتقال ویروسهای آنفولانزای A از حیوانات میزبان به انسان ممكن است به پدید آمدن گونه های جدید با همه گیری جهانی شود . تشخیص زود بهنگام چنین وقایعی در ابقاء ویروسهای آنفولانزا در درحه اول اهمیت قرار دارد . برای تشخیص و تعیین خصوصیت نسبی ویروسهای آنفولانزای A از گونه های مختلف حیوانات روش توأم RT-PCR و (HMA) heteroduplex mobility طراحی گردید. نشان داده شد كه این تغییر پذیری (m) ژن در RT-PCR می تواند حساس شود و برای تعیین ویروسهای آنفولانزای A انسانی و مرغی وخوكی اختصاصی گردد.
قطعات تكثیر شده توسط PCR از ویروسهای انسان ، طیور وخوك از 15 تحت تیپ مختلف،با بین 9/1 و4/21 اختلاف نوكلئوتیدی بوسیله روش HMA تمایز گذاشته شد .
تعیین توالی ampliconها نشان داد كه الگوی تغییر پذیری هترودوبلكس بااختلاف توالی ها بین DNA مورد آزمایش ورفرنس مرتبط می باشد . متد تكثیرRT-PCR HMA برای جستجوی سریع نمونه ها با یك پانل رفرنس از منشأ ویروسهای انسانی ومرغی وخوكی تشخیص داده شد .
ویروسهای مرغی (A / Hongkong / 1073 / 99) H9N2 كه با گونه های انسانی واكنش متقاطع داشتند در مقابل panel رفرنس مورد بررسی قرارگرفتند . مشخص شد كه محصولات PCRاین سویه بیشترین شباهت را با سویه (A / Quil /Hongkong / GI / 97 ) H9N2 دارد. بررسی توالی ها نشان داد یك اختلاف 101% نوكلئوتیدیبین قطعات amplicon مربوط به A / Quil /Hongkong / GI / 97 و A / Hongkong / 1073 / 99 وجود دارد . با توجه به نتایج كار ما ، روش RT-PCR HMA یك راه سریع و حساس برای جستجوی ویروسهای آنفولانزای جدیدوغیرمعمول
می باشد.شناسایی ویروسهای آنفولانزا معمولاُ شامل رشد ویروس در كشت بافت یا جنین تخم مرغ ، قبل از بررسی تایپها یا ساب تایپها بوسیله ممانعت از هماگلوتیناسیون (HI) می باشد .
لیكن ، این كارها وقت می برد وشناسایی گونه های منشأ ویروس ضروری نمی باشد . به همین دلیل ماروش (RT) – PCR براساس ژن ماتریكس (M) توأم با روش هترودوبلكس (HMA) mobility برروی محصولات PCR پایه گذاری كردیم .
پروسه خالص سازی نوكلئیك اسیدهای ویروس باشناسایی توسطHMA24 تا36 ساعت وقت می برد و می توان بطور مستقیم آن را برروی نمونه های كلینیكی انجام شود . روش RT-PCR HMA كه در اینجا شرح داده می شود به تشخیص زود به هنگام انتقال داخل گونه ای بین میزبانهای انسانی وحیوانی كمك خواهد كرد .

مواد و روشها :
جداسازی ویروس :

ویروسهای آنفولانزا درحفره های آلانتوئیك جنین تخم مرغ رشد می كند . مایع حاوی مایع آلانتوئیك جداسازی شده ودردمای 70c تا موقع مورد نیاز نگهداری
می شود . ویروسهایی كه در این مطالعه استفاده شده اند در جدول شماره 1 لیست
شده اند .
ویروسهای /Taiwan/7310/10 ، A/SW/oms/2899/82 ، A/SW/oms/3633/84، /SW/Scotland/410440/94 ، A/SW/hongkong/168/93 ،A/HK/1774/99 و A/HK/1073/99 بوسیله yipu lin و alan hay مؤسسه بین المللی تحقیقات پزشكی در mill hill انگلستان فراهم شد .
جدا سازی A/DUCK/singapor q/f 119-3/97 بوسیله آزمایشگاه دامپزشكی منشعب از مركز دامپزشكی سنگاپور انجام گرفت .
ویروس تایپنگ : ویروسهای آنفولانزا كه تایپ می شوند با استفاده از آنتی سرم موش خرما همانطوری كه قبلاُ شرح داده شد انجام می شد . تمام تستهای HI با استفاده از HAU 8 از ویروسها و 5% سلولهای قرمز (vol/vol) turkey انجام گرفت .

سنتز cDNA وخالص سازی نوكلئیك اسید :
RNA ویروسی از یك میزان 150mg از نمونه بوسیله روش باند شدن با گوآنیدینوم تیوسیانات باسیلیكا همانطوری كه قبلاُشرح داده شد انجام گرفت . rna ویروسی در 30 از نوكئازها وآب آزاد حل می شود .
RT از RNA به CDNA بوسیله اضافه كردن 2/22 از RNA به 8/17 مخلوط RT حاوی 20Mm Tris-Hcl (PH=8/4) ، 50 Mm ، KCL و 7/5 Mm ، mgcl2 و 3Mm از هر داكسی نوكلئوتید تری فسفات و 25ng از پرایمرهای راندم (pdn6) و 1/6 u از rnasine و2007 از revers transcriptase ویروس لوسمی موشی (moloney) انجام می شود .
این مخلوط در دمای 20c برای 10 دقیقه انكوبیت می شود وسپس در 37c برای 45 دقیقه نگهداری می گردد . سپس نمونه ها برای 65 دقیقه تا 100c حرارت می بینند وبعد روی یخ گذاشته می شوند .
مواد اصلی PCR : توالی های پرایمر بدنبال بررسی نواحی حفاظت شده از ژن m مربوط به ویروسهای آنفولانزای A بدست آمدند.خصوصیات پرایمرها بانرم افزار oligo primer analysis بررسی می شوند .جفت پرایمری كه در مایه RT- PCR مربوط به m gene مورد استفاده قرار می گیرددر جدول شماره 2 آمده است.
پرامر خارجی ،amp71f قبلاُ برای استفاده در یك مایه pcr برای تعیین ویروسهای آنفولانزای انسانی طراحی شده است . هر جفت پرایمر در مجاورت مقدار مشخصی از mgcl2 ، نمك و PH انجام می گیرد. برای PCR اولیه، 20 L از cdna به 80 L مخلوط PCR حاوی 8 L از بافر 10XPCR ((PH : 8/4) tris- hcl , 200Mm و kcl 500ml ) و2/4 l از mgcl2 50mm و 1 l ازهرپرایمر خارجی در l (amp 71f ,amp831r ) 5 pmol/ و 6/7/3 l از نوكلئاز – آب آزاد و /3 l از DNA, taq پلی مراز استفاده می شود .
دمای اپیتیم برای چسبیدن برای جفت پرایمروحالت چرخشی بااستفاده از یك mastercycler Gradient thermalcyler تعیین می گردد . تكثیر اولیه بوسیله 1 سیكل در دمای 94c برای 2 دقیقه انجام می شود وبعد با 30 سیكل دناتوره كردن در دمای 94cبرای یك دقیقه دنبال می شود وتواماُ چسبیدن وطولانی شدن در دمای 68c برای 1/5 دقیقه انجام می شود . محصولات اولیه تكثیر یافته از ویروس های رشد كرده برروی تخم مرغ به نسبت 1 در 10000 قبل از تكثیر ثانویه رقیق می كردند . یك مقدار از محصول اولیه (2 l) سپس به 48 l از مخلوط ثانویه pcr حاوی 5 lاز10 xpcr buffr (ph:8/4)tris-hcl ,200mm) و (kcl 500mm و 1 l از مخلوط داكسی نوكلئوزید تری فسفات و 1/5 l از 3 l , 50mm mgcl2 ازهر پرایمر داخلی در 25 pmol/ l (amp227f , amp 622r) و 34/2 l از نوكلئاز-آب آزاد و /3 l از DNA, taq پلی مراز اضافه می كنیم . نمونه ها در دمای 94c برای 1 دقیقه انكوبیت می شوند وسپس برای 32 سیكل در معرض 94c به مدت 1 دقیقه و60c برای یك دقیقه و72c برای یك دقیقه قرار می گیرند .
Amplicon های (413bp) بوسیله رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید قابل رؤیت می شود و متعاقبأ برروی ژل آگارز2% الكتروفور می شود . جدول شماره 2

-تعیین حساسیت روش (I RT-PCR) تیتراسیون عفونت زایی ویروس :

روش های عفونت زایی همانطور كه قبلاُشرح داده شدبا تغییرات كوچكی انجام می گیرد . تعداد10رقت (10 -10)
از ویروسهای syd/97(h3n2) و DK/sing/97(h5n3) و HK/1073/99(h,n2) در محیط ترانسپورت ویروسی تهیه گردید . (vtm) ذمان انكوباسیون به 72 ساعت دریك انكوباتور co2 در 37c تغییر پیدا می كند . سلولهای كلیه سگ madin-darby بوسیله گلوتارآلدئید5% فیكس گردیدند وپلاكه بوسیله رنگ آمیزی با محلول كربول فوشین 5% vol/vol قابل رؤیت شدند .
RT-PCR(ii) : مقداری ازمحلول تازه وزنده ازهرویروس(100 l) حل شده در vtm در مجاورت عصاره نوكلئیك اسید و RT-PCR همانطوركه قبلاُشرح داده شد قرارداده می شود .

روش Heterduplex :

متدهای آنالیز hma كه قبلاُ شرح داده شد برای مطالعه گونه های مشابه ویروس نقص ایمنی انسان تیپ 1 آداپته شدند . برای hma ، 3 l از نمونه محصول pcr با 3 l ازمحصول pcrرفرنس و /3 l از بافر hmaحاوی1 m nacl و 100mm tris (ph:7/8)و 20mm edta مخلوط می گردد.
نمونه ها سپس در دمای 95cبرای 2 دقیقه دناتوره می شوند وسریعاُ تا دمای4c سرد می شوند . سپس برای 10 دقیقه برروی یخ گذارده می شوند .سپس بافر(1/3 l) gel loading اضافه می شود .
برم فنل بلو1% و glycerol و(g x ; tris-boric acid-edta{tbe} , 1% xylen cynol) نمونه ها برروی ژلهای پلی ساكاریدی غیر دناتوره 8% در(nove x TBE ) 1 x TBE برای 50 دقیقه در ولتاژ 200V الكتروفورز می شوند.همودوبلكس ها وهترودوبلكس ها بدنبال رنگ آمیزی ژل با sybr greenII قابل رؤیت می شوند.
تعیین توالی وبررسی فیلوژنیك : تعیین توالی نوكلئوتیدی amplicon های pcr m ژن بااستفاده از روش dye deoxy terminator انجام گرفت .
محصولات PCR m ژن بااستفاده از جفت پرایمر داخلی PCR amp227f و amp622r در 3/2 pmol/reaction تعیین توالی شدند. بررسی فیلوژنیك خوشاندی به دنبال تعیین توالی با استفاده از برنامه magaling4 انجام گرفت .

نتایج :

- تعیین میزان حساسیت و اختصاصی بودن RT-PCRبرای m ژن: حساسیت تشخیص ویروس آنفولانزایA بوسیله روش RT-PCR برای Mژن با استفاده از سه ساب تیپ ویروس آنفولانزایA به نامهایsyd/97(h3n2) و dk/sing/97(h5n3) و Hk/1073/99(h9n2) انجام گرفت . رقتهای سریال و متوالی از عصاره ویروسی تازه این ویروسها در vtm تهیه گردید. ازهررقتی، نوكلئتیك اسیدها برای سنتز cDNA و PCR جمع آوری شدند. به همین میزان نیز به ارزیابی عفونت زایی این روش ازهررقتی گرفته شد كه همان روز انجام گرفت در این الگو ، رقت نقطه پایان برای عفونت زایی ویروس می توانست مستقیماُ با نقطه پایان تشخیص RNA ویروسی بوسیله RT-PCR مقایسه گردد.
M ژن كه برای RT-PCR به كارمی رود 10pfu از ویروسهای آنفولانزایA (H9N2 , H5N3 , H3N2) درمیلی لیتر می باشد .این با حساسیت گزارش شده برای تشخیص ویروسهای آنفولانزایA وB بوسیله روش NESTED RT-PCR بااستفاده از پرایمرهای اختصاصی برای ژنهای HAاز ویروسهای آنفولانزایA وB می باشد.RT-PCR برای میزان توانائیش در تشخیص ویروسهای آنفولانزایA از انواع حیوانات ومیزای اختصاصی بودنش برای ویروسهای آنفولانزایA مورد آزمایش قرار گرفت .
یك محصولی با اندازه ای كه انتظار می رفت (413bp) هنگامی كه ویروسهای آنفولانزای A مرغی ، انسانی یا خوكی آزمایش شدند بدست آمد . (جدول 1 و شكل 1)
این نتایج نشان می دهد كه توالی های mژن ویروسهای آنفولانزای A تمام حیوانات آزمایش شده را می توان با پرایمرهای لیست شده در جدول 2 تكثیر كرد .یكسری محصولات نامعلوم PCR هنگامی كه ویروسهای آنفولانزایB تست شدند مشاهده شدند ، كه دلالت بر اختصاصی بودن PCR برای توالی های ویروسهای آنفولانزای A می كند .
تعیین مشخصات آمپلیكونهای Mژن بوسیله HMA وتأئید توالی های آن :
بعد از تكثیر Mژن بوسیله RT-PCR اختصاصی بودن محصول PCR برای هرویروس بامنشأ میزبانی خاص بوسیله HMA مورد تحقیق وتخصص قرارگرفت . این كار با استفاده از بررسی طریقه فرم گرفتن هترودوبلكس بین آمپلیكونهای یك ویروس آنفولانزایA انسانی رفرنس (bay/95) وآمپلیكونهای ویروسهای مورد آزمایش از 15 ویروس آنفولانزای A مختلف از ساب تایپهای انسانی و خوكی ومرغی صورت گرفت . (جدول شماره یك ) (نتایج در شكل 2 نشان داده شده اند)
هترودوبلكس هایی كه بین آمپلیكونهای سویه رفرنس (BAY/95) ومحصول PCR هر ویروس مورد آزمایش مشاهده می شوند ، منعكس كنند تغییر توالی بین ویروس رفرنس وDNA ویروس مورد آزمایش می باشد .
هیچ هترودوبلكسی در ستونی كه حاوی فقط محصول PCR رفرنس می باشد مشاهده نمی شود .(lane 1,17) .كمترین كاهش در تغییر هترودوبلكس درجایی مشاهده می شود كه محصول ویروس رفرنس (bay/95) با آمپلیكون ویروس wuh/371/95 مخلوط گردیده است (lane 2) . هر دو ویروس bay/7/95 و wuh/371/95 از سویه های ویروس آنفولانزای انسانیA ،H1N1 می باشند .
بررسی توالی ها بر این امر دلالت می كند كه آمپلیكونهای Mژن ویروسbay/95 و wuh/371/95 تا 9/1% اختلاف دارند .(جدول 3)
بنابراین آمپلیكونهای با بیشتر از 2% variation درتوالی نوكلئوتیدی بوسیله این روش HMA می تواند متمایز گردد .
هیچ اصلاحی در دوباره حل شدن باند وقتی كه 10% ، 20% ، یا گرادیان ژلهای پلی آكریل آمید استفاده شد مشاهده نشد . بیشترین میزان كم شدن در تغیرپذیری در ستونی مه آمپلیكون رفرنس از bay/95 با محصولات pcr ویروسهایی كه دارای mژنهای ویروسی خوكی یا مرغی مخلوط شده اند مشاهده می گردد .(ستون 3 و4 و7 تا 16). اختلافات نوكلئوتیدی بین آمپلیكونهای pcr از این ویروسهای مرغی وخوكی وویروس رفرنس انسانی سویه bay/95 بوسیله بررسی توالی بین 5/14% و 4/21% مشاهده شد . میزان متوسط الگوی تغییر هترودوبلكس در مخلوطهای حاوی آمپلیكونهای pcrاز ویروسهای انسانی (bay/95) H1N1 وویروسهای انسانی H3N2 تست و syd/97 و wuh/359/95 مشاهده شد بررسی توالی ها یك اختلاف نوكلئوتیدی 7/6 تا 9/7 درصدی را بین ویروس H1N1 انسانی و آمپلیكونهای mژن ویروس انسانی H3N2 تست مشاهده شد .
ارزیابی یك الگوی رفرنسHMA برای تعیین انتقال بین گونه ها :

یك پانل از 9 و یروس آنفولانزای A با ژنهاب M كه در دودمان انسانی ، خوكی وطیور وجود دارند ساخته شد .
RNA از اینها و یك ویروس تست خالص سازی می شود (HK/1073/99) و RT-PCR روی آن انجام می گیرد .
آمپلیكونهای با اندازه ای كه اتنظار می رفت (314bp) بوسیله ژل آگاروز الكتروفورز قابل رؤیت می شود (شكل (A 3 یك قسمتی از هر آمپلیكون رفرنس برای hma با محصول pcr ویروس تست (HK/1073/99) مورد استفاده قرار گرفت . (نتایج در شكل 3B نشان داده شده است ). بیشترین كاهش در تغییر پذیری هترودوبلكس هنگامی مشاهده شد كه آمپلیكون HK/1073/99 با آمپلیكونهای ویروس انسانی رفرنس مخلوط گردید . (ستون 1 و 2)كه دلالت بر فاصله زیاد توالی Mژن ویروس مرغی با انسانی دارد . هترودوبلكسهایی كه هنگام مخلوط كردن محصول PCR ویروس HK/1073/99 با آمپلیكونهای رفرنس مشتق شده از ویروسهای خوكی و انسانی تشكیل شدند الگوهای تغییر پذیری گوناگونی را نشان دادند
بیشترین شباهت را با آمپلیكون PCR ویروس مرغی QU/HK/GI/97 H9N2 مشاهده شد (ستون7) . هیچگونه هتروبلكسی هنگامی كه آمپلیكونهای Qa/hk/gi/97 و hk/1073/99 مخلوط شدند مشاهده نشد كه دلالت بر كم بودن اختلاف این آمپلیكونها از میزان حساسیت تست HMA دارد. نتایجHMA بوسیله تعیین توالی مستقیم آمپلیكونهای PCR ، Mژن از 9ویروس رفرنس وویروس تست تأئید گردید. بررسی توالی ها نشان داد كه اختلاف نوكلئوتیدی بین آمپلیكونهای Qa/hk/gi/97 و hk/1073/99 بمیزان 1/1%می باشد .

- بحث :

بیشترین شباهت را با آمپلیكون PCR ویروس مرغی H9N2 Qa/HK/GI/97 , مشاهده شد « ستون 7» . هیچگونه هترو دوبلكسی هنگامی كه آمپلیكونهای Qa/HK/GI/97 و HK/1073/99 مخلوط شده اند مشاهد نشد كه دلالت بر كم تر بودن اختلاف این آمپلیكونها از میزان حساسیت تست HMA دارد . نتایج HMA بوسیله تعیین توالی مستقیم آمیلیكونهای PCR ، mژن از 9 ویروس رفرنس و ویروس تست تایید گردید . بررسی توالی ها نشان داد كه اختلاف توكلئوتیدی بین آمپلیكونهای Qa/HK/GI/97 و HK/1073/99 به میزان 1/1% ازخوك یا طیور به انسان كم
می باشد اما چنین وقایعی می توانند منجر به میزان بالایی مرگ ومیر می شود واحتمال پدید آمدن ویروسهای جهانی را به دنبال دارد .

تشخیص زود هنگام وتعیین خصوصیت واریانت های جدید آنفولانزا كه پدید آمده اند یكی از اهداف شبكه جهانی حفاظت درمقابل آنفولانزا سازمان بهداشت جهانی می باشد .
از این رو ، دست یابی به تستهای سریع كه بتواند ویروسهای جدید و غیر معمول كه ممكن است دارای یك منشا به صورت مخزن حیوانی باشند ضروری است . متدهای سریع ، مانند ایمونوفلورسنس و enzyme immunoassay برای تشخیص ویروسهای آنفولانزا در نمونه های كلینیكی به كار رفته اند .

گزارش شده كه روش ها دارای اختصاصیت وحساسیت متغیری هستند و مشخص نیست كه چگونه معرفهای دخیل دارای توانایی معادل در تعیین ساب تایپهای ویروسهای آنفولانزای حیوانات مختلف هستند . ارزش روشهای PCR برای تشخیص ومحافظت ویروسهای آنفولانزا در مواد كلینیكی بخوبی نشان داده شده است . روشهای تكثیر برای تشخیص و ساب تایپ كردن ویروسهای آنفولانزای A وبرای تفریق ویروسهای آنفولانزای A,B,C شرح داده شده است . لیكن این روشها به طور اختصاصی برای تشخیص ، نگهداری ویروسهای آنفولانزای انسانی طراحی شده اند وبیشتر احتیاج است كه تستهای سریع جهت تشخیص ویروسهایی كه میزبان آنها موجوداتی غیر از انسان هستند طراحی گردند ، اخیراً یك RT-PCR تك لوله ای بر پایه m ژن برای تشخیص ویروسهای آنفولانزای A مربوط به چند گونه شرح داده شده است .
دراین مطالعه ما یك متد توأم PCR-HMA را برای شناسایی وتعیین خصوصیت نسبی ویروسهای آنفولانزای A از گونه های مختلف طراحی كرده ایم .
ژنm1 بعنوان هدف انتخاب شد چراكه شواهد چنین پیشنهاد می كنند كه m1 ORF در میان ویروسهای آنفلولانزای A از گونه های مختلف میزبان به میزان زیادی حفاظت شده هستند. RT-PCR برای mژن نشان داده شده كه برای تشخیص ویروسهای آنفولانزای A ، 15 ساب تایپ مختلف با منشاء انسانی ، مرغی وخوكی اخصاصی وحساس می باشد . متدهای بعد از تكثیر برای بررسی تغییر توالی در آمپلیوكنهای PCR شامل بررسی RFLP ها و HAM ها می باشد.
ارز یابیRFLP ، محصولات m ژن PCR برای ساب تایپینگ ویروسهای آنفلانزای A انسانی و تفریق 6 ژن داخلی شامل m ژن ویروسهای انسانی H1N1,H3N2 , و ویروسهای مرغی H5N1 شرح داده شده است . اشكال احتمالی تكنیك RFLP این است كه موتاسیون در توالی نوكلئوتیدی آن مورد نظر ممكن است منجر به از دست دادن یا پدید آمدن باند شدن آنزیم محدود كننده شود . میزان بالای موتاسیون پذیری RNA ژنوم ها ، مانند ژنهای ویروس آنفولانزا احتمال رخ دادن این موتاسیونها را افزایش می دهد .
از آنجائیكه كه بررسی هترودوبلكس نشان داد كه برای تفریق سریع ویروسهای RNA دار بسیار مناسب می باشد وبدلیل اینكه سایتهای مناسب آنزیمهای محدود كننده كه ویروسهای انسانی ، مرغی وخوكی را متمایز می سازد در آمپلیكون 413 bp ژن m شناسایی شده اند ، HMA برای تعیین خصوصیات آمپلیكون m ژن انتخاب شد .
HMA بر مشاهده تغییرات توالی بین آمپلیكون های ویروس تست كه باعث پدید آمدن جفت نشدن درست با سویه رفرنس می شود ودر نتیجه هترودبلكس ها متعاقباً دناتوره می شوند ودوباره می چسبند استوار است .
هتروبكلس ها آهسته از همودوبلكس های هم اندازه خود مهاجرت می كنند وكاهش قابلیت حركت متناسب با میزان اختلاف بین دو توالی موجود درمخلوط دارد . درجه تغییر مورد نیاز برای تفریق مناسب هترودوبلكس ها نشان داده شده كه بین طیف 25 و 5% می باشد.

درجه اختلاف بین آمپلیكونهای m ژن مرغی ، خوكی ، و انسانی بینابین طیف می باشد و باعث تشكیل هترودولكس ها ی قابل تشخیص می شود . « جدول 3 »
شیفت در mobility هترودوبلكس مشاهده شد كه مرتبط با اختلاف بین DNA تست و رفرنس بود كه اختلافی به كمی 9/1 تا 1/1 % اختلاف توكلئوتیدی قابل تشخیص بود .

این موضوع با گزارشات قبلی تعیین اختلاف 4 تا 4/1 درصدی قابل قیاس بود . در این كار بهترین تمایز بوسیله HMA هنگامی مشاهده شد كه محصولات اولیه PCR قبل از تكثیر ثانویه رقیق شد .
از این موضوع می توان نتیجه گرفت كه هنگام آزمایش مستقیم نمونه های كلینیكی كه حاوی تیترهای پائین تری از ویروس نسبت به مواد رشد كرده بر روی تخم یا سلول هستند این كار ضروری نخواهد بود .
مناسب بودن متد PT-PCR HMA ما برای جستجوی نمونه های در یك شیوع بوسیله مقایسه یك تست ویروس با یك RAMEL ویروسهای رفرنس ارزیابی می گردد . سویه آنفولانزای مرغی H2N2 ( HK/1073/99 ) بعنوان ویروس تست انتخاب گردید چرا كه این ویروس مرغی از یك بچه 4 ساله درهنگ كنگ جدا شده است.
یك ارتباط عالی بین نتیجه HMA و اختلاف نوكلئوتیدی وجود دارد برای تشخیص بوسیله تعیین توالی مستقیم وبررسی پلی ژنتیك آمپلیکونهای ویروس تست و رفرنس .

بوسیله HMA، آمپلیكون PCR رفرنس مربوط به Qa/HK/GI/97 ارتباط دارد . این ارتباط بر اساس گزارشات قبلی با 1% اختلاف توكلئوتیدی بین m ژنهای HK/1073/99 , Qa/HK/GI/97 همراه می باشد . درمجموع ، نتایج كار ما نشان می دهد كه انجام توأم HMA,RT-PCR بر روی m ژن یك ابراز قوی برای تشخیص وشناخت ژنتیك ویروسهای آنفولانزا می باشد .HMA یك راه ساده وحساس برای جستجوی m ژنهای ویروس های آنفولانزای جدا شده می باشد وفقط 36 تا 24 ساعت وقت لازم دارد . اگر چه متد RT-PCR HMA برای بررسی نمونه های دستگاه تنفس در این مطالعه مورد استفاده قرار نگرفته ولی چنین نتیجه گیری می شود كه این متد می تواند بطور مستقیم برای تست ویروسها در نمونه های كلینیكی به كار رود بدون اینكه ضرورتی به رشد ویروس اول بر روی سلولهای محیط كشت یا جنین تخم مرغ باشد .

حساسیت روش m ژن RT-PCR كه شرح داده شد قابل قیاس با حساسیت روش RT-PCR كه در آن از پرایمرهای اختصاصی ژنهای HA ویروسهای آنفولانزای B,A برای تعیین ویروسهای آنفولانزای B,A به طور مستقیم درنمونه كلینیكی می شود می باشد . ویروسهای آنفولانزای جدید وغیر معمول را كه بوسیله HMA شناسایی شده اند می توان بسیار وسیعتر بوسیله تعیین توالی مستقیم و HI تایپینگ شناسایی وتعیین خصوصیت كرد . پانل HMA ویروس رفرنس را كه ماساختیم نیاز خواهد داشت كه با اطلاعات بدست آمده از ویروسهای كه در بین انواع حیوانات درچرخش است به روز شود . سرانجام ، تكنیك تركیبی RT-PCR هترودوبلكس می تواند برای شناسایی دیگر ژنهای داخلی ویروس آنفولانزا بكار رود .
بیماریزای عصبی ویروس آنفولانزای H5N1ژنوتیپ جدا شده از طیور هنگ كنگ در 2001 در موش

خلاصه :
ما پاتوژنسیته 5 ژنوتیپ مختلف ( E تا A ) را از ویروسهای آنفولانزای مرغی H5N1 مطالعه كردیم كه حاوی ژنهای HA مشابه ویروس H5N1 A/goose /Guangdong/1/96 و 5 تركیب مختلف ژنهای داخلی در یك مدل موشی می باشد . واریانت های نوروتوپیك وبسیار پاتوژن ویروس از ژنوتایپهای A,C,D,E از مغز بعد از یك پاساژ داخل بینی در موش جدا شدند . ژنوتیپ ویروس B فقط از ششها جدا شدند .واریانت های مغز موش دارای آمینواسیدهای تغییر یافته در محصولات تمامی ژنهایشان بجز پروتئین های PB1,NP,NS1 بودند اما شامل موتاسیونهای معمول نبودند . ما نتیجه گرفتیم كه منشاء ژنوتیپی H5N1/01 از A,C,D,E بصورت هتروژنوس می باشد ودیگراینكه ورایانت های بسیار پاتوژن نوروتروپیك می توانند سریعاً در موش انتخاب شوند .

**CASSIATORA** · Jun-21-2008, 21:16

بیماری آنفولانزای طیور (قسمت سوم)

مقدمه :
شیوع ویروس آنفولانزای A,H5N1 در هنگ كنگ در سال 1997 ، 6 نفر از 18 نفری را كه عفونی شده بودند از بین بردواولین مورد مستند انتقال مستقیم ویروس آنفولانزای مرغی از طیور به انسان بود .
شیوع منجر به گسترش بیماریهای جدی كشنده شد وبعضی به آن بعنوان نخستین حالت پاندمیك اشاره می كنند .
كشتار تمام طیور در فروشگاههای فروش طیور زنده در هنگ كنگ در دسامبر 1997 باعث از بین رفتن منبع عفونت و جلوگیری از انتقال بیشتر به انسانها شد . ویروسهای H5N1 انسانی جداشده (/97 H5N1 ) تصور می شود كه بطور طبیعی از نوترتیبی ویروس های مرغی پدید آمده اند كه ژن ( HA ) هماگلوتینین بسیار با این ژن در ((A/goose/Guangdong/1/97(H5N1))) همولوگ می باشد وكمپلكس همانند ساز آن بمیزان زیادی با كمپلكس مانند ساز یروسهای (H9N2)A/guail/Hongkong/GI/97,(H6N1)Alteal/Hongkong/W312/97 مشابه می باشد .
ژن نورآمینیداز (NA ) ویروس H5N7/97 همچنین بطور نزدیك با این ژن در ویروس Alteal/Hongkong/W312/97 همولوگ می باشد .

در طول سالهای 1999 و2000 ویروسهای H5N1 شبهGO/Gd به خرچه زندگی خود در غازها درجنوب غربی چین ادامه دادند . این ویروسها با ویروسهای با منشاء مرغان آبی نوتركیبی داشتند وژنوتیپهای چندتایی ویروسهای H5N1 حاوی ژنهای NA,HA از ویروسهای شبه GO/Gd در فروشگاههای طیور هنگ كنگ بین فوریه وMay 2001 دوباره ظاهر شدند.
این ظهور دوباره ویروسهای H5N1 در پرندگان خاكی اولین بار بود كه بعد از اپیدمی دسامبر 1997 رخ می داد ومنتج به دومین میزان تلفات در طول 4 سال زندگی طیور درهنگ كنگ خصوصاً‌در ناحیه اجرائی گردید. تمام ویروسهای H5N1 جداشده از طیور در فروشگاههی خرده فروش طی زمستان وبهار 2001 نوتركیبهایی بودند كه حاوی ژنهای NA,HA در درمان GO/Gd وژنهای داخلی دیگر ویروسهای مرغان آبی بودند .
5 نوع از نوتركیب ها با ژنوتایپهای طراحی شده A,B,C,D,E مشاهده شدندد وبا توجه به منشأ فیلوژنی وساختار ژنهای داخلی گروه بندی شدند . ویروسهای تمام 50 ژنوتیپ شدیداً‌ برای جوجه ها وبلدرچین ها بیماریزا بودند همچنین تمام 5 ژنوتیپ برای موش هنگامی كه با دوزبالا باویروس عفونی تلقیح می شدند كشنده بودند . ویروسهای 4تااز 5 ژنوتیپ ازمغز موشهایی كه علائم اختلال سیستم عصبی مركزی CNS را داشتند جدا شد. پاتوژنیسته ویروس آنفولانزای A در موش معمولا نیاز به آداپته شدن با میزبان جدید ، كه طی رشد چند نسل پی درپی « پاساژهای پشت سرهم » ویروس در مغز یا ششها رخ می دهد .

مطالعه كسب بیماریزایی در طول آداپته شدن در موش نشان داد كه ویروسها آداپته شده با موش كه پنموویرولانس و نوروویرولانس هستند نشان داده كه با موتاسیون در NS,M,NA,NP,HA یك یا ده تا از ژنهای پلی مراز همراه می باشد .
برخلاف دیگر ویروسهای آنفولانزای A مرغی وانسانی ، سویه های مرغی و انسانی هنگ كنگ H5N1/97 جدا شده دارای پاتوژنیسته درموش می باشند بدون آداپته شدن . ویروسهای H5N1/97 در پاتوژنسیته برای موش هتروژنوس هستند : تعدادی از جداشده ها بسیار بیماریزا بودند و بصورت سیستمیك تكثیر می كردند درحالی كه دیگران دارای بیماریزایی كمتری بودند ودر دستگاه تنفسی تكثیر می كردند . پاتوژنز ویروسهای H5N1/97 درموش از دیگر ویروسهای شدید غیرپاتوژن H5 متمایز می باشد وشمای ملكولی فتوتیپهای H5N1/97 كه در موش بسیار پاتوژن هستند تعیین شده اند . بعلاوه ، Hatta وهمكارانش با استفاده از تكنیكهای معكوس ژنتیكی بر پایه پلاسمیدنشان دادند كه وجود یك لیزین در بنیان 627 در پروتئین PB2 ویك محل شكست پلی بازیك در HA برای بیماریزایی شدید و تكثیر سیستمیك ویروس (H5N1)A/Hongkong/483/97 درموش قطعی می باشد .

پاتوژسیته فتوتپهای كم و بسیار پاتوژن دریك مدل موش صحرائی عقیم مورد مطالعه قرار گرفته است : هر دوفتوتیپ شدیداً در موش صحرائی بیماریزا بودند بر خلاف بیماریزایی متفاوتی كه درموش دیده می شد .
پاتوژنسیته ویروس (H5N1 ) A/Hongkong/156/97 انسانی مورد مطالعه قرار گرفت . این ویروس بطور كارآمد در دستگاه تنفسی تكثیر می كند وقطعات ژنی بوسیله PCR درمغز وتعدادی ارگانهای داخلی عفونی شده تشخیص داده شدند اما هیچ گونه تكثیر سیتسمیك دراین ویروس مشاهده نشد .
درمطالعات فعلی ، ما از یك مدل موش برای تعیین خصوصیات پاتوژنسیته 5 ژنوتیپ ویروسهای H5N1 2001 هنگ كنگ درمیزبانهای پستاندار استفاده كردیم . ویروسهای 4 ژنوتیپ از 5 ژنوتیپ بعد از تلقیح به داخل بینی از مغز موش جدا شدند . ما بیماریزایی را برای موش وشمای ملكولی این واریانت های نوروپاتیك موجود در مغز موش (MB) را با ویروس جدا شده با منشاء H5N1/01S را مقایسه كردیم نتایج دال بر تاثیر ژنهای داخلی بر روی پاتوژنسیته ویروسهای H5N1 مرغی در میزبانهای پستاندار و احتمالاً انتخاب سریع واریانت های بسیار پاتوژن و نورویرولانت می باشد .

ویروسها :
ویروسهای 5 نوع H5N1 مرغی ، از هر 5ژنوتیپ كه در بهار سال 2001 در هنگ كنگ جدا شدند در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفتند. « شكل 1»
Genotype A,A/chicken/Hongkong/yu822.2/2001(ch/hk/yu822.2/01)
Genotype B,A/chicken/Hongkong/yu562/2001(ck/hk/yu562/01)
Genotype C,A/pheasant/Hongkong/Fyl55/2001(ph/HK/Fy155/01)
GenotypeE ,A/Chicen/Hongkong/NT87303/2001(CK/HK/NT87303/01).
ویروسها بوسیله یك پاساژ در جنین تخم مرغ جدا شدند . برای آماده سازی استوكها برای مطالعه درموش ، ویروسها قبلا برای یك بار بیشتر در حفره آلانتوئیك جنین 10 روزه جوجه برای 48تا40 ساعت در دمای c370 پاساژ داده شدند .
مایع آلانتوئیك حاوی ویروس خالص سازی شدند ومیزان عفونت زائی آنها در تخم
مرغ ها تیتر شد . تیترهای ویروس بعنوان log10 -50% از دوز عفونی كننده تخم مرغ در ml1/0 از مایع بیان می شد . (log10 50% EID50 per0.1 ml) با توجه به متد Reed , Muench . استوكهای ویروس به دو دسته زنده وتازه و دسته نگهداری شونده در 80- تا موقع مصرف تقسیم بندی شدند .
تمام مطالعات با ویروسهای H5N1 در سطح +3 ، Biosafty انجام گرفت آزمایشگاه توسط بخش كشاورزی ایالت متحده دراختیار محققین گذارده شد .
بیماری زائی وتمایل بافتی ویروس H5N1 اصلی جدا شده از موش :
موش ماده 5/1 ماهه BALB/C برای این مطالعات مورد استفاده قرار گرفتند . برای تعیین 50% دوز كشنده در موش ( MLD50) ، 4گروه ازموشها بوسیله استنشاق ایزوفلوران بیهوش شدندوبا ml 1/0 از مایع آلانتوئیك در سالین بافرفسفات بصورت تلقیح داخل بینی عفونی شدند (PBC ) « 10 رقت پشت سرهم از تا حیوانات روزانه وزن شدند و برای 20 روز تحت نظر گرفته شدند .
تیتراسیون MLD50 نشان داد كه تمامی 5 ژنوتیپ ویروسهای H5N1/01 از گروه دارای پاتوژنسیته كم در موش بودند به همین دلیل آنها بطور قابل توجه ای ایجاد بیماری ومرگ ومیر فقط در روز بالا ایجاد می شد .« جدول 1»
بدلیل اینكه ویروسها دارای ارزشهای EID50 مشابه بودند مارقت از مایع آلانتوئیك را كه حاوی تقریباً از ویروس به عنوان دوز عفونی برای مطالعات بیشتر بر روی پاتوژنسیته انتخاب شدند . گروههای 18 تا 26 موش ها با ml 501 از مایع آلانتوئیك رقیق شده با PBS بصورت داخل بینی مورد تلقیح قرار گرفتند .
3 موش از هر گروه در روزهای 3و7 بعد از تلقیح برای تعیین تیتر ویروس در ریه كشته شدند « روز 3 » ودر مغز و ارگانهای داخلی « روز 3و7» .
موش باقی مانده در هر گروه بصورت روزانه وزن شدند وبرای 20 روز تحت جهت مشاهده علائم بیماری ومرگ ومیر تحت نظر گرفته شدند .
شش ها ، مغز ، طحال ، كبد ، كلیه ، وقلب هر موش مرده یا حیواناتی كه مرحله پایانی بیماری كشته می شدند خارج شدند . ارگانها در PBS سرد شسته شدند ، وزن شدند، له شدند ودر PBS سرد با آنتی بیوتیكها برای به دست آوردن یك هموژن 10% هموژنیزه شدند . ناخالصی های نمك بوسیله سانتریفیوژ كردن درz,000 g برای 10 دقیقه ته نشین شدند .
بافت هموژن نشده به درون حفره آلانتوئیك جنین 10 روزه تخم مرغ تشخیص محدوده پائین تر ویروس 0.1log10 EID-DO/0.1ml از بافت هموژن می باشد .
3تا7 روز بعد از تلقیح هیچ ویروسی در مغز یا ارگانهای داخلی موش قابل تشخیص نبود. لیكن ویروس در مغز وارگانهای داخلی موش كه علائم نورولوژیك را نشان می داد 8تا10 روز بعد از تلقیح قابل تشخیص بود « بطور عمده فلج پای عقب »
نتایج بررسی پاتوژنسیته وبافت گرایی 5 ژنوتیپ H5N1/01 را به سه گروه تقسیم
می كند . گروه اول شامل ویروسهای ژنوتیپهای A,B هستند كه ابتدا در ریه های موش همانند سازی می كنند . عفونی شده با ویروس CK/HK/YU822.2/01 ، ویروس از شش ها ، مغز وارگانهای داخلی جدا شده ویروس به میزان كافی درمغز این حیوان همانند سازی كرده بود . تیتر ویروس CK/HK/YU822.2/01در كبد ، طحال وكلیه خیلی پائین بود .
« ویروس فقط از بافت هموژن رقیق نشده جدا شد .» ویروس ژنوتیپ B فقط در
شش های موش عفونی قابل تشخیص بود . عفونت با این ویروس باعث 55% مرگ ومیر گردید. گروه دوم متشكل از فقط یك عضو بود . ph/HK/FY155/01 ( ژنوتیپ c) ، كه در شش ها ومغز عفونی موش همانند سازی می كند .
عفونت با این ویروس منتج به بیشتر میزان مرگ ومیر گردید . این ویروس از مغزهای موش كه دارای فلج پیشرفتهای عقبی بود وتلف شده بود یا اینكه در روزهای 7تا10 بعد از تلقیح كشته شده بود جدا شد .29% از حیوانات تلف شده « 7/27 % از عفونی ها » دارای ویروس درمغز بودند .
ویروس ژنوتیپ c در شش ها ومغز موش با تیترمشابه ای ، كه حداكثر میزان را نسبت به بقیه ژنوتیپ ها داشت همانند سازی كردند.
گروه سوم ، شامل ویروسهای ژنوتیپ D,E كه همچنین در شش ها مغز موش عفونی تكثیر می كنند باشد اما بیشتر از ژنوتیپهای دیگر نوروتروپیك هستند ، تمام موشهایی كه بعد عفونی شدن بااین ویروسها مردند دارای ویروس در مغز بودند . نرخ مرگ ومیر موش عفونی شده با CK/HK/FY150/01 « ژنوتیپ D »
و CK/HK/NT873.3/01بترتیب 5/61% و 3/33% می باشند . موش های عفونی شده با ویروسهای ژنوتیپ E,D دچار فلج پای عقبی ، paresis , tremors قبل از مرگ در 10 تا 14 روز بعد از تلقیح می شدند .
پاتوژنسیته وتمایل بافتی واریانت های H5N1 جدا شده از مغز موش :
واریانت های نوروتروپیك ویروسهای اصلی ژنوتیپهای A,C,D,E « واریانت MB» از مغز بوسیله كشت مغز هموژن ویروس مثبت در تخم مرغ جنین دار 10 روزه با یك با پاساژ جدا سازی شدند .
ارزش EID50 , MLD50 همانطور كه در بالا شرح داده شد تعیین گردید . برای مطالعه پاتوژنسیته وتمایل بافتی ، گروههایی متشكل از 4 حیوان بصورت درون بینی با ml 1/0 از مایع آلانتوئیك رقیق شده باPBC حاوی تا از ویروس عفونی مورد تلقیح قرار گرفتند .
مغز ، شش ها و ارگانهای داخلی موش كه مرده بود یا در مرحله پایانی بیماری كشته شده بود خارج شدند .
واریانت های CK/HK/YU822.2/01 , MB, Ph/HK/FY155/01 –MB, CK/HK/FY150/01 –MB , CK/HK/NT87303/01 –MB طراحی شدند بطور قابل
توجه ای از ویروسهای اصلی بیماریزاتر بودند . این واریانت ها ارزش MLD50 مشابه با ارزش EID50 آنها داشت كه دلالت بر پاتوژنسیته بالای این ویروسها برای موش دارد . واریانت های MB با توجه به تمایل بافتی شان دریكی از دو گروه قرار می گیرند .
گروه اول شامل واریانت های با پاتوژنسیته بالا از ژنوتیپهای A,C می باشد كه بصورت سیستمتیك تكثیر پیدا می كنند و مغز وارگانهای داخلی را عفونی می سازند . دوزهای بسیار عفونی كننده از این واریانت های MB منتج به مرگ در روزهای 3و5 شده ،‌دوزهای پایین تر موشها را 6 تا 11 روز بعد از تلقیح می كشد . تلقیح با دوزهای تا از هر دو ویروس سبب ایجاد علائم نورولوژیك مانند فلج پاهای عقبی ، tremor , paresis گردید.
تیتر ویروس واریانت MB از ژنوتیپ های A,C در كبد و طحال وكلیه وقلب حداقل log102 تا 5/3 پایین تر از تیتر آنها در شش ها ومغز بود ، جایی كه واریانت ها بطور كافی همانند سازی می كنند . این نتیجه پیشنهاد می كند كه این واریانت ها ی MB پنموتروفیك ونوروتروفیك هستند .
گروه دوم شامل واریانت های MB از ژنوتیپ E,D هستند كه فقط در شش ها و مغز موش های عفونی تشخیص داده شده اند .
واریانت ژنوتیپ D موش را 4تا8 روز پس از تلقیح می کشدومیزان EID5025/1 10از وریروس عفونی باعث فلج پاهای عقب و Paresis در روزهشتم بعد از تلقیح می شود . واریانت MB از ژنوتیپ Dدر شش ها ومغز تمامی موشهای مرده یا كشته شده تشخیص داده شدند .
پاتوژنسیته CK/HK/NT873.3/01- MB « ژنوتیپ E» مشابه با واریانت ژنوتیپ D می باشد ، بیشتر حیوانات در روز نهم مردند وعلائم نورولوژیك درموش عفونی شده با دوزهای 25/3 10 و 25/2 10 و 25/1 10 EDI56 مشاهده شد . ویروس ژنوتیپ E از شش ومغز هر حیوان تلف شده یا كشته شده جدا شد . تیترهای واریانت های ژنوتیپ درشش ها ومغز مشابه بودند .

بررسی هیستوپاتولوژیك :
با تغییرات لوكالیزه پاتولوژیك در CNS باعث بروز علائم نورولوژیك می گردد ، نمونه های مغز وطناب نخاعی موش عفونی شده با CK/HK/YU822.2/02 – MB
« ژنوتیپ A» وموشهایی كه درمرحله پایانی بیماری از بین رفتند در بافرخنثی فرمالین 10% فیكس گردیدند ، درواكس پارافین تثبیت شدند ، برشهای 5 زده شدند ، با هماتوكسیلین وائوزین رنگ شدند و برای تغییرات هیستوپاتولوژیكال مورد ارزیابی قرار گرفتند.
دژنره شدن نرونها ونوروفاژیا با التهاب در اثر فیلتر نشدن گلرانولوسیتها وسلولهای مونونوكلوئر به ناحیه ساقه مغز و طناب نخاعی محدود می شد .
انفیلتراسیون سلولهای منونوكلوئر همچنین در مننژها و در فضاهای Prevascular ساقه مغز و neuropil طناب نخاعی دیده می شود .
در طناب نخاعی ، همچنین یك دژنره شدن معمول سلولهای گلیال را داریم ونرونهای با كروماتین های حاشیه ای ویك انكلوژن ائوزینوفیلیك كه به طور نسبی یا كاملا هسته را پر می كند . دژنراسیون نرونی و انفیلتراسیون التهابی همچنین در تعدادی از ریشه های dorsal گانگلیا مشاهده شد وتعداد زیادی از كانونهای نكروزه وسلولهای التهابی به همراه بافت تخریب شده مشاهده گردید.

مرفولوژی پلاك :
یكی از خصوصیات مهم ویروسهای آنفولانزا در توانایی تشكیل پلاك در سلولهای كشت داده شده می باشد . همانند پاتوژنسیته ، این خصوصیت می تواند طی انتخاب شدن در موش تغییر پیدا كند . مرفولوژی پلاك می تواند منعكس كننده هتروژنسیتی جمعیت ویروسی باشد . ارزیابی پلاك در سلولهای MDCK همانطوری كه در قبل شرح داده شد انجام می گیرد . ویروسهای با منشاء ژنوتیپ های A,B,C,D تشكیل پلاكهای بزرگ را كه بخوبی قابل تشخیص می باشد می دهند كه این از خصوصیات ویروسهای آنفولانزای مرغی بسیار پاتوژن می باشد . ویروس ژنوتیپ ( CK/HK/NT873.3/01 ) E پلاكهای كوچك و كدر را تشكیل می دهد.
پلاكهایی كه بوسیله ویروسهای با یك منشاء تشكیل می شود هموژنوس بودند . پلاكهایی كه بوسیله واریانت های MB تشكیل می شدند بزرگترازآنهایی بودند كه بوسیله منشاء تشكیل می شد و واریانت MB ژنوتیپ (CK/HK/NT873.3/01 – MB ) پلاكهایی را تشكیل می دهند نسبت به پلاكهای ویروس منشاء بهتر شناسایی شده است . هیچ پلاكی مانند آنهایی كه بوسیله واریانت های MB در سلولهای MDCKعفونی شده با ویروس های منشاء مشاهده می گردد تشكیل نمی شود .
افزایش مشابه دراندازه پلاك در واریانت های MB ژنوتیپهای C,D مشاهده گردید .
مقایسه توالی های ویروسهای منشأ و واریانت های MB
مطالعات در موش نشان می دهد كه تلقیح منشاء ویروسهای H5N1/01 جداسازی شده از ژنوتیپ های A,C,D,E درموش منتج به انتخاب واریانت های بسیار پاتوژن وعصب دوست می شود . با مقایسه تمام ملكول ایزوله های منشاء و واریانت های MB و تعیین اساس ملكولی بیماریزای در موش وتمایل به عصب ، تمام ژنهای پدید آورنده واریانت های MB تعیین توالی شدند .
RNA ویروسی از مایع آلانتوئیك حاوی ویروس با استفاده از RNeasyminikit جدا سازی شد . پرایمر uni-12 برای نسخه برداری معكوس مورد استفاده قرار گرفت .
PCR با دسته ای از پرایمرهای عمومی كه برای قطعات ژنی ویروسهای آنفولانزای A اختصاصی می باشد انجام شد . محصولات PCR با كیت خالص سازی سریع PCR (QIA ) خالص سازی شدند. عملیات تعیین توالی و بررسی نمونه ها درمركز بیوانفورماتیك وبیوتكنولوژی Harwell در بیمارستان تحقیقاتی كودكان St.Jvde انجام گرفت . تعیین توالی DNA كامل شد ، ویرایش شد ، ترجمه گردید وبا استفاده نرم افزار بررسی توالی به نام Lasergene بسته بندی گردید .
بررسی فیلوژنیك توالی های كل ژنوم از ژنهای واریانتهای MB H5N1/0 ، ویروس منشاء و CK/HK/YU562/01 ( ویروس ژنوتیپ B كه از مغز موش جدانشده بود) نشان داد كه ایزوله های منشاء دارای همان پراكندگی مشابه 5ژنوتیپی هستند همانطوری كه قبلاً براساس تعیین توالی نسبی توالی مشاهده شده بود .
واریانت های متمایل به عصب جدا شده از مغز موش متعلق به دسته مشابه ای از ژنوتیپها بود همانطوری كه در ابتدا درموش به طریقه داخل بینی تلقیح شده بود.
تغییرات توالی های آمینواسیدی بین ویروس های original و واریانت های MB آنها با آنهایی كه بین فنوتیپهای موش H5N1/97 انسانی با پاتوژسیته بالاوپایین یافت میگرد مقایسه گردید. تغییرات آمینواسیدی در واریانت های بسیار پاتوژن در تمام محصولات ژنی وجو داشت بجز پروتئین های NS1,NP,PB1 بیشترین تغییرات ویروسهای original رااز واریانت های MB متمایز می ساخت ، همانطور كه از دیگر ویروسهای با پاتوژنسیته بالاو پایین تمایز می ساخت وآنها منحصر به فردنبودند . طبیعت اتفاقی این تفاوتها پیشنهاد می گردد كه ویروسها هتروژنوس هستند ودلالت می كند براینكه احتمال انتخاب سریع واریانت های بسیار پاتوژن وجود دارد .
این پیشنهادات بوسیله هتروژنسیته توالی های original از ژنهای PA,PB2 تایید
می شود بخصوص در ژنوتیپ های A,C,D . واریانت MB از ژنوتیپ A(CK/HK/YU822.2/01 – MB ) از ویروس original بوسیله تغییرات منحصر به فرد در بنیان 738 در PB2 پلی مراز ، بنیان 10 و 212 در PA پلی مراز ، بنیان 50 در HA وبنیان 86 در NS2 وبوسیله حذف 20 آمینواسیدوجانشینی G به جای S70 در NA متمایز شدند . واریانت MB از ژنوتیپ C دارای 4 آمینو اسید منحصر به فرد بودند كه در موقعیت های 305 و 307 و 627 در PB2 ودر موقعیت 501 در PA در واریانت MB از ژنوتیپ D یك جانشینی منحصر به فرد در بنیان 97 در PA وجود دارد در حالیكه واریانت MB از ژنوتیپ E دارای چنین تغییراتی نبود . این موتاسیونهای منحصر به فرد ممكن است در اكتساب بیماریزای بالا و بیماری زای برای عصب در واریانت های MB دخیل باشند .
عدم وجود چنین تغییرات منحصر به فردی در واریانت MB از ژنوتیپ E می تواند در ابتدا بوسیله نوروتروپیسم بالا وبیماریزائی پایین ویروسهای original جدا شده از موش شرح داده شود. تغییرات متعاقب در واریانت MB ممكن است دارای اثر بیماریزائی داشته باشد ولی اثر نورویرولانس ندارد .
ویروسهای H5N1 هنگ كنگی مرغی وانسانی كه در سال 1997 جدا شده اند دارای ژنوتیپهای مشابهی هستند :
هتروژنیستی پاتوژنسیته آنها درموش نتیجه یك اختلاف كوچك در توالیهای ژنومهای ویروسی بود . در مقابل ویروسهای H5N1 جدا شده از فروشگاههای طیور هنگ كنگ ر سال 2001 از 5 ژنوتیپ مختلفی كه به طور طبیعی وجود داشتند بودند . این ویروسهای H5N1/97 و H5N1/01 به طور معمول فقط دارای ژن NA « كه از نظر فیلوژنیكی نزدیك به ویروسهای شبه GO/Gd می باشند » ویروسهای شبه GO/Gd كه در سال 1999 در هنگ كنگ جدا شدند. جدژنهای HA,NA وتعدادی از ژنهای درونی ویروسهای H5N1/01 بودند كه نشان داده شده دارای بیماریزایی كمی درموش بوده اند : این ویروسها به طور موثر در ششهای موش همانند سازی می كردند وفقط یكی از آنهایی كه جدا شدند ومورد مطالعه قرار گرفته اند به میزان خیلی كم درمغز ردیابی شده اند مافهمیدیم كه بیشتر ویروسهای H5N1/OS original همانند ویروسهای H5N1/99 شبه GO/Gd دارای پاتوژنسیته كمی در موش بودند وبه بافت عصب نیز تمایل داشتند . لیكن بر خلاف ویروسهای شبه GO/Gd ویروسهای H5N1/01 چها تار از 5 ژنوتیپ A-E در مغز موش قابل تشخیص بودند . زخمهای اختصاصی ویروس در ساقه مغز وطناب نخاعی وجراحات التهابی ریشه های بالایی گانگلیا دلالت می كند بر اینكه این واریانتهای MB نوروتروپیك از ششها به مغز به طریق انتقال سیناپسی بوسیله اعصاب حسی منتشر
می شوند . یك مسیر انتقال عصبی ویروس هم همچنین در موش عفونی شده با ویروسهای مرغی H5N3 كه درجوجه ها اداپته و بسیار بیماریزا شده بودند ، مشاهده شد . ویروس ژنوتیپB به طور موثر در ششهای موش همانند سازی می كنند و سبب مرگ ومیر می شوند . اما درمقابل ویروسهای ژنوتیپ A,C,D,E ویروس ژنوتیپ B از مغز جدا نشد . تلقیح موش با واریانتهای MB جدا شده از مغز نشان می دهد كه این واریانتهادر موش بسیار بیماریزا هستند وحداقل دارای بیماریزای مشابه در موش هستند همانطور كه ویروسهای H5N/97 با فتوتیب بسیار بیماریزا این كار را انجام می دهند . انتخاب واریانت نوروتروپیك از 5 ژنوتیپH5N1/01 طی تكثیر در موش سریع به وقوع می پیوندد واریانتهای MB بسیار پاتوژن فقط طی یك پاساژ ویروس تولید می شوند. چنین انتخاب سریعی احتمالاً بوسیله اقامت طولانی غیر معمول این ویروسها در ششها امكان پذیر
می گردد « ما این ویروس را از ششهای موش در روزهای 8 تا 12 بعد از تلقیح جدا كردیم . » یافته های ما دلالت می كند براینكه ارقام ژنهای داخلی در ویروسهی H5N1/97 كه از چرخه حیات بوسیله كشتار تمامی طیور در سال 1997 خارج شد .
فقط تركیب ژنها نبود كه منبع به پاتوژنسیته بالای این ویروس در طیور وپستاندران شد : قطعات مختلف چندتایی ژن داخلی ویروسها كه به طور رایج درجنوب شرقی چین درچرخه هستند می توانند كامل بكنند ژن HA ویروس شبه GO/Gd برای تولید ویروسهای كه بسیار بیماریزا هستند و در میزبان پستاندار خاصیت نوروتروپیك دارند. بنابراین HA ویروسهای شبه GO/Gd كه دارای سایتهای برش چندتایی هستند ممكن است یك نقش كلیدی را در بیماریزای ویروسهای مرغی H5N1 هنگ كنگی در گونه های پستاندران فقط هنگامی كه بوسیله یك تركیب مناسب با ژنهای داخلی كامل شوند ایفا كنند .
ویروس ژنوتیپ A ازنظر داشتن ژنهای PA,M از رده فیلوژنیك شبه GO/Gd با ژنوتیپ B متفاوت است. ژنوتیپهای C حاوی ژنهای NP,BP1 از ویروسهای شبه GO/Gd است كه این ژنها ژنوتیپ C را از ژنوتیپ A,B متمایز می سازد.
ژنوتیپ های D,E فقط در ژن NP شان با همدیگر وباژنوتیپ C فرق می كند ویروس ژنوتیپ B حاوی ژنهای HA,NA ای است كه از نظر فیلوژنی به ویروسهای شبه GO/Gd نزدیك می باشد این ژنها باعث می شوند كه این ویروسها در رده پرندگان وحشی دریایی ناشناخته باقی بمانند . ما پیشنهاد می كنیم كه جمعیت ویروسی ژنوتیپ B هموژنوس می باشد . چرا كه هیچ واریانت بسیار پاتوژنی از این ژنوتیپ طی یك پاساژ در موش انتخاب نمی شوند . ژن HA از ویروس ژنوتیپ B كه دارای سایتهای برش چندتایی كه از ویروسهای شبه GO/Gd منشاء گرفته اند به تنهایی كافی نیستند . تا معرف یك ویروس با بیماری زایی بالا و نوروتروپیسم در موش حداقل طی یك پاساژ باشد .
درمقابل جمعیت ویروس ژنوتیپ B جمعیتهای ویروسی ژنوتیپ های A,C,D,E هتروژنوس هستند چرا كه یك پاساژ از این ویروسها درموش منجر به انتخاب واریانتهای بسیار پاتوژن می شوند . مقایسه توالی ها بین واریانتهای MB وفتوتیپ ویروسهای H5N1/97 هنگ كنگی كه برای موش بسیار پاتوژن هستند و ویروسهای اداتپه شد . با موش هیچ گونه از سریهای معمول موتاسیونها را نشان نمی دهد .
فقط جانشین K به جای E627 در PB2 در واریانت MB ژنوتیپ C كه مشاهده شده مشابه موتاسیون بود كه مسئول بیماریزایی بالایی ویروس HK/483/97 بود اما این موتاسیون فقط در ویروس ژنوتیپ C یافت می شد . فقدان یكسری موتاسیونهای رایج در واریانتهای بسیار پاتوژن و نوروتروپیك پیشنهادمی كندكه راههای مختلف زیادی برای ویروسهای آنفلونزای H5N1/01 هنگ كنگی برای دستیابی به بیماری بالاونوروتروپیسم در موش وجود دارد . شرط لازم برای نوروویرولانس ویروسهای H5N1/01 هنگ كنگی درموش وانتخاب سریع فنوتیپ های بسیار پاتوژن در میزبان جدید ممكن است به دلیل شكل گیری ویژه كمپلكس ژنهای همانندساز باشد .
محلهای برش چندتایی در HA ضروری می باشد . اما برای اینكه این ویروسها را بسیار پاتوژن ونوروویرلانت در موش باشد كافی نمی باشد ، تغییرات اختصاصی در پروتئینهایPA,PB2 پلی مراز در این فرایند دخیل هستند بنابراین ما حدس می زنیم كه انتخاب واریانتهای بسیار پاتوژن نوروتروپیك طی نوترتیبی طبیعی بوسیله بالا رفتن هتروژنسیته ویروسی از اضافه شدن ژنهای PA « ژنوتیپ A و PB2 « ژنوتیپهای C,D,E» از منشاء شبه GO/Gd به زمینه كمپلكس همانند ساز از یك رده فیلوژنی دیگر تسهیل می شود . سوال در مورد ارتباط پاتوژنسیته ویروسهای H5N1 هنگ كنگی در موش باتوانایشان در بیماریزای در انسان ودیگر گونه های پستانداران منطقی می باشد . لیكن انتخاب سریع واریانتهای نوروتروپیك درموش ارتباط نزدیكی با انتخاب سریع مشابه واریانتهای بیماریزا برای پستانداران دارد . تصمیم كشتار طیور در هنگ كنگ در سال 2001 یك راه مفید برای ریشه كنی این ویروسها وجلوگیری از انتخاب چنین واریانتهای بسیار پاتوژنی بود .

Accession توالیهای نوكلئوتیدی
توالیهای نوكلئوتیدی بدست آمده دراین مطالعه در ژن بانك تحت شماره از Accession
AY221592 تا AY221521 نگهداری می شود .
ارزیابی ویروسهای آنفولانزای H5N1 در اردكهای جنوب چین
خلاصه :
پاتوژنسیته ویروسهای آنفولانزا در پستاندران از اواسط دهه 1980 مورد ارزیابی قرار گرفت . دراینجا ، نشان می دهیم كه ویروسهای آنفولانزای H5N1 ، كه از اردكهای به ظاهر سالم mainland چین از سال 1999 ، تا 2002 جدا شده اند ، بطور تصادفی پاتوژنسیته آنها برای پستانداران بالا رفته است ، وبطور فرضی مكانیسم این ارزیابی مستقیم را شرح می دهیم . 21 ویروس از اردكهای بظاهر سالم در جنوب چین از سال 1999تا 2002 جدا شدند كه تایید شد اینها تحت تیپهای ویروس آنفولانزای A , H5N1
می باشند . این ویروسهای جدا شده از نظر آنتی ژنتیكی به ویروس H5N1 A/GOOSE/Gvangdong/1/96 مشابه می باشند كه منبع ژن هماگلوتینین آنفولانزای پرندگان در هنگ كنگ در سال 1997 بود و تمامی آنها در جوجه ها بسیار بیماریزا بودند .
ویروسها به 4 پاتوتیپ بر اساس همانند سازی و قدرت كشندگی برای موش تقسیم بندی شدند . یك الگوی واضح در افزایش تصاعدی بیماریزای این ویروسهای جدا شده در مدل پستانداری وجوددارد . 5 تا از 6 H5N1 جدا شده در مرغابی هایی كه مورد تلقیح قرار گرفتند همانند سازی كردند وآنها از مجرای كلوآكه وتراكه ریزش ویروسی داشتند ولی هیچ كدام علائم بیماری را نشان نداند واز بین نرفتند . بررسی فیلوژنیك ژنوم كامل دلالت بر این امر دارد كه بیشتر ویروسهای نوترتیب حاوی ژن شبیه A/GOOSE/Guangdong/1/96 هماگلوتینین هستند و دیگر ژنها از ویروسهای ناشناخته روسی می باشد . این مطالعه بر روی تعین خصوصیات ویروسهای آنفولانزای H5N1 كه اخیراً‌ در میان اردكهای mainland چین در چرخش است متمركز می باشد . یافته های ما پیشنهاد می كند كه یك تلاش سریع و بلادرنگ برای جلوگیری از انتقال ویروسهای آنفولانزای مرغی بسیار پاتوژن از اردكهای به ظاهر سالم به جوجه ها یا میزبانهای پستانداری ضروری می باشد .

مواد وروشها
جدا سازی ویروس وشناسایی آن :
بعد از شناسایی ویروس A/Goose/Guang/1/96 (GSGD/1/96) (H5N1) بعنوان یك پیش ساز مهم ویروس آنفولانزای هنگ كنگی سال 1997 (HK/97) مراقبتهای روتین برای آنفولانزای مرغی توسط مسئولین در شهرهای Castol چین و استان های Guangdong , Guanxi,Fujian , Zhejiang , Shanghai شروع شد .
نمونه های كلوآك از اردكهای به ظاهر سالم مزارع گرفته شدند . ویروسها در جنین تخم مرغ همانطوری كه در رفرنس توضیح داده شده جداسازی شدند . تمام 21 ویروس H5N1 بوسیله تست های جلوگیری از هماگلوتیناسیون ( HI ) ونورآمینیداز « NI» با یك جدول آنتی سرمی كه بوسیله دفتر بین المللی آزمایشگاه رفرنس به نام Des Epizooties محدود در چنین اختصاصی _ بیماریزا وتخم مرغ آزاد بطور بیولوژیكی كلون گردید . تمامی آزمایشات با ویروسهای H5N1 جدا شده در یك سطح biosafety با امكانات 3 آزمایشگاه انجام گرفت وآزمایشات بر روی حیوانات در isolator های با هوای فیلتر شده وضریب كارآیی بالا ( HEPA – filtered ) انجام گرفت .
آزمایش حیوانات ، جوجه ها :برای تعیین پاتوژنسیته ویروسهای جدا شده شاخص بیماریزائی V 10 ( IVPI ) تست شد با توجه به دستور كار دفتر بین المللی DesEpizooties .
گروههای 10 تایی جوجه های سفید Leghorn ، 6 هفته واختصاصی و عاری از عوامل پاتوژن در قفس های جدا كننده نگهداری شدند وبا 2/0 ml از یك رقت 10/1 مایع آلانتوئیك عاری از باكتری وحاوی ویروس بصورت 10v مورد تلقیح قرار گرفتند
( تیترهای ویروسی در جدول شماره 1 نشان داده شده است )
10 جوجه اضافی بطریقه داخل بینی ( x10 ) با 6 10( eID50 ) egg 50% infeetive dose از هر ویروس در یك طیف 1/0 ml مورد تلقیح قرار گرفتند ، در روز سوم ، 3 تا از جوجه های هر گروه تلف شدند ومیزان ویروس در نمونه های شش ، bursa ، كلیه ، تیموس ، غده تیروئید ، مغز ، قلب ، پانکراس ، ماهیچه معده ، طحال وتراكه تعیین تیتر گردید . تست های مشابه بر روی پرندگانی كه تلف شده بودند انجام شد . این بافتها همچنین از نظر هیستوپاتولوژیكی مورد مطالعه قرا گرفتند ، آنهادر بافر خنثی محلول سیلین 10% فیكس شدند وبا هماتوكسیلین وائوزین رنگ شدند . نمونه های فیكس نشده برای عفونت زائی ویروس درجنین های تخم مرغ تیتر شدند .
موش : گروههای 8 تایی موش های ماده BALB 6 تا 8 هفته كمی با CO2 بیهوش شدند وبصورت n 10 با 0.610 ( CID50) از ویروسهای آنفولانزای H5N1 در یك طیف 50 ml مورد تلقیح قرار گرفتند.
موش كنترل با PBS تلقیح شد . در روز 3 ، سه تا از 8 موش را برای تیتر كردن میزان ویروس در شش ها ، كلیه ها ، طحال ، ومغز كشته شدن . دوز حداقل كه 50% موشها را می كشد ( MLD50 ) بوسیله متد Muench , Reed محاسبه شد .
اردكها : گروههای 5 تایی از اردكهای 3 هفته بطریقه x10 با 85.7 10 تا 5.8 10 ( eIO50 ) از ویروس آنفولانزا در 1/0 ml مورد تلقیح شدند . اردكها روزانه برای 10 روز از نظر بروز علائم بیماری تحت نظر گرفته شدند . نمونه های سوآپ كلوآك و oropharyngeal ازتمامی اردكها ، 3 و 5 روز بعد از تلقیح برای تیتراسیون ویروس در تخمها جمع آوری شدند .
بررسی ژنتیكی وفیلوژنیكی : RNA ویروسی از مایعات آلانتوئیك بوسیله استفاده كیت RNeasy , Mini خالص سازی شدند و نسخه برداری معكوس شدند . تكثیر با PCR بوسیله استفاده از پرایمرهای اختصاصی قطعات انجام گرفت . محصولات PCR با Kit خالص سازی QIA-quick PCR خالص سازی شدند و با استفاده از كیت Quick start – CEQDTCS بر روی یك DNA سكوانسر CEQ8000 تعیین توالی شدند . اطلاعات مربوط به توالی هابا برنامه SEQMAN نوشته شدند وتوالی های نوكلئوتیدی مقایسه شدند ودرخت فیلوژنیك با برنامه MEGALIGN با استفاده از الگوریتم مسیر GLSTAL ساخته شد .
شماره Accession توالی های نوكلئوتیدی : توالی های نوكلئوتیدی كه در این مطالعه به دست آمدند از ژن بانك با شماره :
( accession nos . AY585357 – AY85524 ) قابل دسترسی هستند .

نتایج :
بررسی آنتی ژنیكی : تستهای HI , NI با آنتی سرمهای رفرنس نشان داد كه هر یك از ویروسها تحت تیپهای H%N! می باشند . ویروسها دارای الگوی مشابه واكنش HI < NI هیچ گونه شواهدی دال بر دریفت آنتی ژنتیكی در ویروسهای جدا شده از 1999 تا 2002 وجود ندارد بعنوان مثال تیترهای هترولوگوس HI كمتر از 4 بود – تا خوردگی كمتر از تیترهای هترولوگوس HI بود .
مطالعات در جوجه ها : ما از IVPI وروش پیشنهادی دفتر بین المللی Des Epizooties برای ارزیابی بیماریزایی ویروس درجوجه ها استفاده كردیم .
تمام جداشده ها ، با این معیار بیماریزا بودند « جدول 1 » . لیكن یكی از آنها زودتر جدا شدند ( OKGX/07/99 ) فقط نیمی از جوجه هایی را كه به صورت V10تلقیح شده بودند كشتند. ومیانگین زمان مرگ (MDT) دو تا از جدا شده های اولیه 8 روز بعد ازر تلقیح به صورت x 10 بود . ویروسهای H5N1 جدا شد در سال 2000 تنوع در MDT
( 807 تا 303 ) بعد از تلقیح به صورت x 10 نشان دادند ، در حالی كه نمونه های جداشده در سالهای 2002 و2001 دارای MDT بین 7/1 و4 بعد از تلقیح x 10 بودند ( تنها استثناد DKGX/53/02 بود كه یك MDT بیش تر از 5/6 بود ) .یك تمایل به زیاد شدن افزایش در IVPA در وقت اضافی وجود دارد . در 7 تااز نمونه های جدا شده در 1999 و 2000 IVPA 3-9/2 بود. استثناء DKGX/53/02 بود كه IVPA آن 1/2 و MDT بیش تر از 5/6 روز داشت كه دال بر پاتوژنسیته خیلی كمتر می باشد ، تمام جوجه هایی كه در روز 2و3 بعد از تلقیح مردند دارای جراحاتی بودند كه دلالت بر همانند سازی سیستمیك ویروس می كرد . آنها دارای نكروز متوسط بافت مغز ، پنومونی شدید هیستوسایتیك همراه با ادم ، نكروز حادپانكراس ، نكروز خفیف طحال ، نفروزیس حاد یا ضعیف و نكروز خفیف تا حاد بورسابودند . فقط شواهد مربوط به DKGX/07/99 دال بر تكثیر غیر سیستمیك داشت .

مطالعات در موش :
بیشتر ویروسهای شدیداً پاتوژن آنفولانزای مرغی روسی جدا شده از سال 1997 قادر به تكثیر در پستانداران بودند . قبل از تست كردن بیماریزایی آنها در موش ، ما بطور بیولوژیكی هر ویروس جداشده را بوسیله 3 چرخه محدود رقت در جنین های جوجه اختصاصی – بیماریزا وبدون جنین كلون كردیم .
هیچ پاساژ كوری در موش انجام نشد . اطلاعات ما از یك پاساژ x 10 در موش به دست آمده اند .
بر اساس توانایی تكثیر وقدرت كم كردن وزن و ایجاد مرگ ومیر « جدول 2وشكل 1 » ، ویروسهای H5N1 جدا شده به چهار گروه تقسیم شدند . هنگامی كه ویروس از هیچ ارگان موش 3 روز بعد از تلقیح با 6 10eID50 جدا نشد وهیچ كاهش وزنی ومرگ ومیری درموش مشاهده نشد ویروس در موش غیر پاتوژن محسوب می شود . ویروسهایی كه می توانستند درموش تكثیر كنند بیشتر به گروههای پاتوژنسیته كم (LD506.5Log 10 eID50 M ) ، متوسط ( 3log10eID50 MLD50 6.5log10eID50 ) یا زیاد ( MLD 3log10eID50) ، بر اساس قدرت كشندگیشان در موش تقسیم بندی می شدند . گروههای غیر پاتوژن دارای 7 ویروس ( شامل GSGD/1/96) بودند كه در موش تكثیر نمی كردند وباعث كاهش وزن نیز نمی شدند ، فقط یك ویروس ( DKGX/22/01 ) موجب تغییرات سرمی می شدند . گروه كم پاتوژن حاوی 4 ویروس بود كه با تیتر نسبتاً پایینی در ششها تكثیر می كردند، تمام این موشها تا روز 14 بعد از تلقیح دچار تغییرات سرمی شده بودند .

یك دوز بالا از این ویروسها ( eID50 بیشتر از 5.6 10 ) برای كشتن موش مورد نیاز بود تمام 7 ویروس درگروه با بیماریزائی متوسط در ششهای موش تكثیر پیدا كردند . سطح پایینی از دو ویروس درطحال تشخیص داده شد ویكی از ویروسهای جدا شده (DKSH/8/01 ) در سطح خیلی پائینی در مغز یافت شد . تمامی این ویروسها سبب عفونت كشنده درموش شدند اما دوز بالای ویروس ( eID50 6 10 تا 4 10 ) و طیف MLD50( از 407 تا ( 604log10eID50 مورد نیاز بود .
4 ویروس بسیار پاتوژن با تیتر بالائی در ششهای موش تكثیر می یابند و وجود ویروس در طحال ، كلیه ومغز دال بر عفونت سیستمیك می باشد . MLD50 ویروسها در این گروه كمتر از (203log10eID50 ) بود .

ما یك افزایش سطح پاتوژنسیته برای موش را با پیشرفت زمان مشاهده كردیم :ویروسهای جدا شده در سال 1999 و 2000 برای موش كمتر بیماریزا بودند نسبت به آنهایی كه در سال 2000 و2002 جدا شدند ، اگر چه یكی از ویروسهای جدا شده در سال 2000 ( DKGD/40/00 ) در گروه با بیماریزائی متوسط قرار داشت ویكی از ویروسهای جدا شده درسال 2002 ( DKGX/53/02 ) دارای بیماریزایی كم بود .

مطالعات در اردكها :اردكهای وحشی میزبان طبیعی ویروسهای آنفولانزا هستند . تمام تحت تیپهای آنفولانزای مرغی از اردكهای وحشی جدا شده اند وهیچ یك از آنها كه شامل تحت تیپهای بسیار پاتوژن H5,H7 نیز می باشند وهیچ سابقه تاریخی دال بر ایجاد بروز علائم یا مرگ در اردكها ندارند .
بطور غیر منتظره ، ویروسهای H5N1 جدا شده از مرغابی های وحشی در هنگ كنگ در نوامبر 2002 سبب بیماری شدید عصبی شد واردكها را هم درمزرعه وهم در آزمایشگاه كشت . ما گروههای 5 تایی اردكها را با 6 ویروس H5N1 كه نماینده ویروسهای مطالعه شده در این تحقیق می باشند شامل 3 ویروس از زیر گروه بسیار پاتوژن درموش تلقیح كردیم . « جدول 3 ». 5 تا از 6 ویروس H5N1 جدا شده در مرغابی هاهمانند سازی كردند . آنها دارای ریزش ویروسی از تراكه یا كلوآك در سطح 2.0-403log10eID50/ml بودند . ویروسها در اثر تماس پرندگان در ایزولاتور منتقل نشدند وهیچ یك از ویروسها سبب بروز علائم بیماری یا مرگ در اردكها نشد . جدول 3
بررسی ملكولی وفیلوژنتیكی : برای تعین اساس ملكولی مشاهداتمان ، تمامی ژنوم هریك از 21 ویروس جدا شده تعیین توالی شدند. توالی ها با توالی های نماینده H5N1 شامل آنهایی كه از GSGD/1/96 وانواع انسانی جدا شده از هنگ كنگ در سال 1997 HK/156/97 , HK/483/97 , HK/486/97 به دست آمده از بانك ژنی مقایسه شدند .توالی های هماگلوتینین HA ونورآمیند از NA مربوط به ویروس A/duck/Anyang/av – 1/01(H5N1) ( DK/AY/01 ) جدا شده از گوشت اردكهای صادراتی از چین به جنوب كره نیز مورد بررسی فیلوژنیكی قرار گرفتند . شكل 2
ژنهای NA ویروسهای H5N1 جدا شده از ویروسها بیشتر به ژنهای (GSGD/1/96 96.4-9803% همولوژی ) نزدیك بودند تا ویروسهای جدا شده HK/97 ازیك شاخه جداگانه با NA هایی می باشد كه ما از اردكها جدا كردیم . NA های ویروسهای جدا شده از اردكها به دو چنگال تقسیم می شدند كه DKGX/07/99 پایه وستون چنگال GSGD/1/96 , B1 پایه چنگال B2 می باشد . هر یك از این چنگالها حاوی ویروسهای جدا شده از 2000 تا 2002 می باشد. DK/AY/01 در چنگال از GSGD/1/96 مشتق می شود . بررسی توالی های آمینواسیدی بدست آمده نشان می دهد كه تمامی ویروسهای درچنگال كه از GSGD/1/96 مشتق می شوند دارای یك حذف 20 آمینواسیدی در ساقه NA هستند ( بنیان 49 تا 68 ) ، در حالی كه خود GSGD/1/96 این طور نیست . این حذف درساقه NA ، دارای فاصله اما هم پوشانی با حذف 19 آمینواسیدی یافت شد در ویروسهای HK/97 جدا شده از انسانها می باشد . ( بنیان های 54-72 ) . هیچ حذفی در ویروسهای NA در چنگال مشتق شده از DKGX/07/00 وجود ندارد.
درخت فیلوژی ژنهای PA,PB1,PB2 از 22 ویروس H5N1 خیلی شبیه بودند .
« شكل 2 ،‌c_e » . ویروسهای انسانی HK/97 جدا شده از یك شاخه مجزا بودند ، در حالی كه ویروسهای جدا شده از اردكها و GSGD/1/96 به دو چنگال اصلی كه در آن ویروسهایی كه جلوتر جداشده اند بطور غالب در یك شاخه هستند تقسیم بندی می شوند . در درخت فیلوژنی PB2 ، ژنهای دوچنگال در شاخه B سهم زیادی از همولوژی راداشتند ومتعلق به یك دودمان می باشند.
به بیان دیگر، چنگالهای B1,B2 ژنهای PB1.PA دارای 93-90% همولوژی بودند ومی توان آنها را به عنوان دودمان متفاوتی در نظر گرفت .
درخت فیلوژنیك «NP » نوكلئوپروتئین « شكل f 2 » متفاوت بود : ژنهای NP از 3 ویروس جدا شده از اردكها ( DKSH/35/02 , DKSH/38/01 , DKGX/50/01 ) یك شاخه جدا گانه را تشكیل می دهند ، درحالی كه HK/97 t NP انسانی یك چنگال را تشكیل می دهد ودیگر H5N1 های جدا شده چنگالهای چندتایی خواهر را كه با زمان یا محل جغرافیشان مطابقت نمی كند تشكیل می دهند . درخت فیلوژنیك M« ماتریكس » ژن دقیقاً مشابه با درخت ژنهای پلی مراز بود ، اما M ژنهای DKGD/40/00 , DKFJ/19/00 درچنگال متفاوتی در شاخه B كه خودش به باقی مانده ها ، شامل ویروسهای انسانی HK/97در آلل B مجزا می شدند «شكل 2-h » .
4 ویروس اردكی و GSGD/1/96 در آلل A قرار داشتند ، در حالی كه باقی مانده ها ، شامل ویروسهای انسانی hk/97كه خودش به دو شاخه تقسیم می شد قرار می گرفتند . در آلل B كه خودش به دو شاخه تقسیم می شد قرار می گرفتند . توالی های آمینواسیدی بدست آمده از تمام ویروسها درچنگال B1 از شاخه B درالل B دارای یك حذف 15-nt می باشد كه منجر به یك حذف 5 آمینو اسیدی در NS پروتئین می شود . «موقعیت 80 تا 84 » بر اساس تنوع ژنومیكی ، ویروسها 9 ژنوتیپ را تشكیل می دهند كه تكامل و ارتباطات درشكل 3 نشان داده شده است .
این مسئله كه ژنهای مشابه PB2,HA,NA در ژنوتیپ های متفاوت یافت می شوند قابل ملاحظه می باشد. اتصال وارتباط قوی بین ژنوتیپ ویافنوتیپ این ویروسها درموش وجود ندارد ، درحالی كه مسیرواضح از افزایش تصاعدی بیماریزایی این ویروسها در میان ژنوتیپهای مشابه ، بخصوص ویروسهای ژنوتیپ A,D دیده می شود .
DHSH/35/02 ,DKSH/38/01 در ژنوتیپ مشابه قرار دارند . « F » ، اما DKSH/35/02 3 10 بار كشنده تر از DKSH/38/01 در موش می باشد . بیماریزایی متفاوت دو ویروس در ژنوتیپهای گروهی H,I بیشتر از به ترتیب 105X ,106 X می باشد . این نتایج پیشنهاد می كند كه موتاسیونهای بخصوص بیشتر از ساختار ژنومی ممكن است قدرت بیماریزایی آنها را تعیین سازد . شكل 3

بحث :
این مطالعه شرح می دهد كه قبلاً جدا سازی ویروسهای آنفولانزای H5N1 تعیین خصوصیت نشده از اردكهای منطقه mainland چین از GSGD/1/96(H5N1) گزارش
شده اند. یافته های ما نشان می دهند كه ویروسهای آنفولانزای بسیار بیماریزا از اردكهای به ظاهر سالم در استان Coastal چین ( بین Shanghai , Guandong ) از سال 1999 تا 2002 جدا شدند . این ویروس H5N1 جدا شده واكنش آنتی سرمی مشابه داشتند وژنهای HA آنها از نظر فیلوژنیكی هموژنوس بود . تمامی آنها به جز یكی سبب عفونت كشنده و وسیع سیستماتیك در جوجه ها می شدند و همگی دارای یك ردیف هایی از آمینواسیدهای پایه در محل برش HA بودند كه با بیماریزائی بالا همراه بود.
یافته های ما مشخص كرد كه ویروسهای آنفولانزای H5N1 درمیان اردكهای اهلی در چین از 1999 تا 2002 كه درچرخش هستند قادر به تكثیر در موش بوده و سبب عفونت سیستماتیك ومرگ بدون سازگار شدن در موش می شوند .
تعدادی از محققین گزارش كرده اند كه ویروسهای H5N1 جدا شده از انسان برای موش كشنده هستند .
فاكتورهایی زیادی گزارش شده اند كه با بیماریزائی H5N1 همراه می باشند. مطالعات معكوس ژنتیكی نشان داده كه بنیان 627 پروتئین PB2 یك نقش حیاتی در بیماریزائی H5N1 در موش دارد ، همانطور كه داشتن ردیفهایی از آمینو اسیدهای اساسی در محل برش HA همین نقش را دارد . مطالعات دیگر نقش ژن NSوتوانائیش درتعدیل پاسخ سیتوكاینی را بازگو می كند. مطالعات معكوس ژنتیكی نشان داده اند كه بان 92 از ملكول NS1 از نمونه های ویروسهای (H5N1) A/HK/156/97 انسانی با القاء بیماریزائی شدید در خوكها همراه می باشد. لیكن ، تمامی ویروسهای H5N1 اردكی دارای بنیان های آمینو اسیدی حفاظت شده GLV-627 در PB2,ASP-92,GLY-228 ( اعضای H3) در محل باند شدن بارسپتور می باشند . بنابراین ، این بنیانها ممكن است كه در همانند سازی های متفاوت وبیماریزائی ویروسهای H5N1 اردكی در موش شركت نكنند . سوال مهمی كه باقی می ماند این است كه چگونه و چه وقت ویروسهای H5N1 توانایی تكثیر پستانداران را پیدا كردند .

نتایج ما نشان می دهد كه همانطور كه ویروسهای H5N1 در میان اردكهای اهلی در چرخش هستند ، خصوصیاتی درانها پدید می آید كه می توانند برای موش كشنده باشند. یك شرح احتمالی برای این یافته ها انتقال ویروسهای H5N1 از اردك به انسانها ، تكامل انتخابی ویروسها در انسان ها ومتعاقباً انتقال دوباره آنها به اردك می باشد . شواهد محدود سرولوژیكی از عفونت زایی H5N1 انسانی وجود دارد همچنین شواهد محدودی نیز درباره انتقال فرد به فرد ویروسهای H5N1 وجود دارد . شواهد در دسترس پیشنهاد می كند كه از سال 1997 ، ویروسهای آنفولانزای آسیایی باعث عفونتهای محدود كشنده یا حاد در انسانها می شوند ، اما از انسان به انسان منتقل نمی شوند . انتقال بازگشتی ویروسها را از انسانها به اردكها را به سختی می توان اثبات كرد ، علی رغم وجود شواهدی كه در مورد انتقال ویروسهای آنفولانزای مرغی H9N2 از اردكها به دیگر طیور و سپس برگشت آنها به اردكها وجود دارد.
مسئله اساس ملكولی ویروسهای قابل انتقال به پستانداران حل نشده است . بطورعمده ژنهای چندتایی ویروسی ، شامل HA دخیل هستند . تعدادی ساختارهای ژنهای مرغی چنین فرض می شود كه باعث انتقال به پستانداران می شوند. ویروسهای آنفولانزای H3N2كه درخوكها در سال 1997 در ایالت متحده وجود داشته اند نوترتیبهای 3 تایی بودند كه حاوی قطعات ژنی از ویروسهای آنفولانزای مرغی ، انسانی وخوكی بودند. این ویروسهای نوترتیب 3تایی H3N2 درمیان خوكها به میزان بسیار بالایی منتقل می شوند و در ایالت متحده انتشار وسیعی پیدا كردند .
به طور مشابه ، ویروسهای آنفولانزای خوكی H1N1 كه بطور رایج در اروپا دارای انتشار وسیع هستند حاوی ژنهای ویروسهای آنفولانزای مرغی كه در سال 1999 یافت شدند می باشند . در نتیجه ، ژنهای ویروس آنفولانزای مرغی ، وقتی كه آنها قسمت عمده ای از ساختار ژنی باشند ، به نظر می رسد كه بتوانند در میان گونه های پستانداران منتقل شوند . ارزیابی ژنوتیپهای مختلف ویروسهای H5N1 در اردكها ممكن است ساختار ژنهایی را كه سبب انتقال به پستانداران می شوند روشن سازد .
احتمالات متفاوتی در مورد انتخاب خوك بعنوان میزبان وجود دارد .« وجود یك میزبان واسط » . در ناحیه ای از چین كه ویروسهای H5N1 آنها در این مطالعه تعیین خصوصیت شدند ، خوكها واردكها در كنار یكدیگر نگهداری می شوند خصوصاً در مزارع روستایی كه خانواده ها دارای تعداد كمی خوك واردك هستند . فرضیه كار ما این است كه ویروسهای H5N1 بتدریج توانایی تكثیر در پستانداران را از طریق انتخابی كه تحت فشار رخ می دهد وهمچنین احتمال انتقال بین خوكها واردكها پیدا می كنند . امروزه ، هیچ گزارشی از جداسازی ویروسهای H5N1 از خوكها وجود ندارد ، اگر چه خوكها بطور آزمایشگاهی باویروسهای H5N1 عفونی شده اند . ما اخیراً شواهد ویروس شناسی وسرولوژیكی از عفونت زائی ویروس H5N1 در خوكها دراستان Fvjian بدست آوردیم .
با این حقیقت كه یكی از ویروسهایی كه در اینجا مورد مطالعه قرار گرفتند قادر به ایجاد عفونت در اردكهای تلقیح شده نبودند با فرضیه ما هماهنگ نبودند و در اثر تماس با اردكها نیز منتقل نشدند . لیكن ، تجربیات ازمایشگاهی بطور كامل وضعیت یك مزرعه را نمی تواند شبیه سازی كند ، كه ممكن است شامل استرس وعفونت های همراه با چند باكتری یا ویروس باشد . بنابراین ، انتشار ویروس در اثر تماس با اردك به واحدهای ایزولاتور محدود می شود جایی كه مدفوعهای عفونی كننده حیوانات از طریق توری های سیمی به درون محفظه ای می ریزد و ذخیره هوای HEPA فیلتر شده می باشد . لیكن ، می توانیم از یافته هایمان چنین نتیجه گیری كنیم كه ویروسهای H5N1 جدا شده ازمرغابی ها در 2002 در این مطالعه برای اردكها بسیار كشنده نیستند ، همانطوری كه ویروسهای H5N1 جدا شده از پرندگان وحشی آبی در نوامبر 2002 در هنگ كنگ این چنین بودند . جداسازی ویروسهای H5N1 كشنده جوجه ها از اردكهای به ظاهر سالم وجود ویروسهای H5N1 را در گوشت های مرغابی صادراتی به ژاپن وجنوب كره را توجیه می كند . لیكن ، بررسی جزئیات ژنوتایپی 21 ویروسی كه ما جدا كردیم دال بر چرخش ویروسهایی در میان اردكهای منطقه mainland چین در سال 20002-1999 بود كه با ویروسهای H5N1 هنگ كنگی جدا شده از فروشگاههای طیور زنده بوسیله GuaM فرق داشتند . ارتباط بین این ویروسهای H5N1 اردكی با ویروسهای H5N1 جداشده از چین در 2004 بایستی تعیین گردد .
ژنهای HA,PB2 بنظر می رسد كه یك نقش عمده را در تكثیر وبیماریزائی ویروسهای H5N1 در موش دارند . یافته های ما دلالت بر این می كند كه ژنوتایپهای چندتایی ویروسهای آنفولانزای مرغی بطور بالقوه می توانند در پستانداران بیماریزا گردند . بطور مشخص ، ویروسهای آنفولانزای H5N1 بطور مداوم در آسیا درحال ظاهر شدن هستند . مراقبتهای مداوم بهمراه تعیین جزئیات ساختارهای ژنی وتعیین بنیانهای اختصاصی ضرروی برای انتقال به پستانداران حیاتی می باشد .
سمپوزیوم آنفولانزای حیوانات در 16و18 مه 1999

سدهایی كه طیف میزبانی ویروس را تعیین می سازد :
به دلیل نقش HA در تشخیص سلولهای میزبان یكی از مهمترین عوامل تعیین كننده طیف میزبانهای ویروس آنفولانزا می باشد .رسپتورا اختصاصی ویروسهای آنفولانزای مختلف بستگی به حیوانات میزبانی دارد كه از آنها جدا شده اند .
ویروسهای آنفولانزای انسانی ترجیحاً سیالیل الیگوساكارید هایی را شناسایی می كنند كه در انتها دارای یك N استیل سیالیك اسید لینك شده با گالاكتوز بوسیله پیوند 6،2 هستند . ( NevAc 2,6 Gal ) در حالیكه ویروسهای مرغی N استیل سیالیك اسید لینك شده با گالاكتوز را بوسیله پیوند 3و2 شناسایی می كنند .
متقابلاً ، غالب بودن باندهای سیالیك اسید گالاكتوز از سیالیل الیگوساكاریدها در سلولهای اپیتلتال در محلهای همانند سازی ویروس بسته به نوع میزبان متفاوت است .
برای مثال ، سلولهای اپیتلیال در تراكه انسان حاوی بطور عمده NevAC2,6Gal است ، در حالی كه در تراكه اسب و روده اردك « جایی كه ویروسهای مرغی تكثیر
می یابند » حاوی به طور عمده باندهای NevAC2,6Gal می باشد .
جالب است كه سلولهای اپی تلیال در تراكه خوك حاوی هم باندهای NevAC2,6Gal وهم NevAC2,3Gal می باشد كه این موضوع می تواند علت استعداد خیلی بالای این حیوان در ابتلاء ویروسهای آنفولانزای انسانی وحیوانی شود .
درنتیجه ، اختصاصیت میزبان ویروسهای آنفولانزا می تواند تحت تاثیر میزان این دونوع باندهای سیالیك اسید گالاكتوز در سیالیل الیگوساكاریدها درسطح سلول باشد . حتی چنین تصور می شود كه در میزان غالب بون سیالیل الیگوساكاریدها درمحل همانند سازی ویروس های آنفولانزا در بین حیوانات میزبان مختلف فرق وجود داشته باشد .(رفرنس 7 ، صفحه 2 )
بررسی ژنتیك تعیین میزبان اختصاصی از طریق كمپلكس همانند سازی / نسخه برداری ویروس آنفولانزای A
قطعات ژنوم ویروس مرغی نه تنها گلیكوپروتئین های سطحی را « HA ,NA » راكد می كند بلكه همچنین RNA , PB1 پلی مراز را نیز كد می كند . با استفاده از سیستم ژنتیكی ما بر روی این سوال كه چگونه پروتئین هایی كه در فرآیند همانند سازی دخیل هستند اختصاصی بودن میزبان را تعیین می كنند كار كردیم : « 7؛ صفحه 4»

مواد وروشها :
كلون كردن ملكولی CDNAها :
RNALO ویروسی را از ویروسهای A/FPV/ROSTOCK/34 ، A/Mallard/NY/78 . A/Hong kong/156/97 (HK) رشد كرده بر روی جنین 11 روزه تخم مرغ یا برروی سلولهای DMCK جمع آوری كردیم . CDNA ها طول كامل ژنوم بوسیله نسخه برداری معكوس با استفاده از یك پرایمر مكمل pb12 حفاظت شده در انتهای 3 از هر قطعه ویروسی فراهم شدند ومتعاقباً‌ بااستقاده از پرایمرهای اختصاصی هر ژن PB1 , PB2 , PA , NP تكثیر شدند .
CDNA در رشته ای سپس در سایت ECORV از حامل پلاسمیدی PHMG كلون گردید وتوالی های آنها تعیین گردیدند. CDNA بدست آمده از ویروسهای A/PR/8/34(PR8) , A/Victoria /3/75(Victoria) بوسیله به ترتیب A.Portela , J.Pavlovic آماده شدند .
روش همانن سازی گذرا : پلاسمید Ppoli-cat-rt برای اجازه دادن به بیان یك نسخه ساختگی شبه RNA طراحی گردید . مخلوطی از پلاسمیدهای Ppoli-cat-rt(1mg) , Phmg-pb1,pb2,pa,-np(1,1,1,2mg) به سلولهای cos-1 فرستاده شدند ، با استفاده از متد Fugen-Mediated بعد از 48 ساعت انكوباسیون در 37 درجه سانتی گراد ، سلولها جمع آوری شدند و عصاره های سلولی برای فعالیت CAT تست شدند . ( 7 ، صفحه 4). شكل

بحث :
نتایج ما باعث شناسایی آمینواسید 627 از PB2 بعنوان یك تعیین كننده عمده میزان كارآئی كمپلكس همانند سازی ویروس آنفولانزایA در سلولهای پستانداران ، با توجه به مشاهداتی كه قبلا از ویروسهای نوترتیب گزارش شده بود ، شد .

بعلاوه آنها پیشنهاد كردند : كسب قطعه PB1 از ویروس آنفولانزای مرغی می توانست یك امتیاز انتخابی را به ویروسهای نوتیب مانند "آنهایی كه در پاندمی های 1968 و 1957 دخیل بودند اعضا
می كند .
بر هم كنش های PB2-PA ,PB2-NP می توانست در ثبات كمپلكس همانند سازی دخیل باشد وبنابراین ممكن است باعث محدود تعدادی از وقابع نوترتیبی كه در تطابق قطعات ژنی دخیل هستند شود .
بعضی از خصوصیات ملكولی پروتئین های PB1,PB2,PA می توانست برای تعیین بیماریزائی ویروس A/HK/156/97 در انسانها اختصاصی باشد . « 7، صفحه 5 »
دمین های PB2 كه باعث توانایی ایجاد پلاك توسط ویروسهای آنفولانزای مرغی در
رده ای از سلولهای پستانداران می گردد .

**CASSIATORA** · Jun-21-2008, 23:24

بیماری تیلریوز Theileriosis

بیماری تیلریوز یكی از معضل های مهم پیشرفت در صنعت دامداری در اكثر نقاط جهان میباشد . انگلهای تیلریا ‏T. annulata و T. parva مهمترین گونه های اقتصادی و مسئول تلفات و كاهش تولید تخمین زده شده اند.
استراتژی مراقبت از بیماری تیلریوز در بیشتر كشورها بوسیله كنترل ناقلین بخصوص كنه ها میباشد. اما كنترل كنه ها نسبت به روشهای دیگر كنترل این بیماری از اهمیت كمتری برخوردار میباشد زیرا اولا كنه كش ها ( سموم Acaricide ) گران تمام میشوند و ثانیا مقاومت بر علیه اكثر آنها ایجاد شده است. در ضمن مدیریت حمل ونقل و قرنطینه دام بطور جدی قابل اجرا نمی باشد. از دیگر روشهای كنترل بیماری استفاده گسترده از واكسیناسیون میباشد. درمان داروئی معمولا با Parvaquone, Buparvaquone, Halofuginone, برای هر دو گونه ‍T. parva, T. annulata موثر میباشد. اما این درمانها دام مبتلا را مبرا از آلودگی Sterilise نمیكنند.

واكسنهای مورد لزوم :

برای تهیه واكسن برای T. annulata از تیره سلولی شیزونت Schizont-infected cell lines استفاده میشود. این واكسن كه حاوی سلولهای شیزونتی میباشد باید تا كمی قبل از مصرف در دمای انجماد نگهداری شود.
برای واكسینه كردن دامها بر علیه T. parva از روش آلوده كردن و درمان استفاده میشود. بصورتیكه مقداری كنه آلوده جمع آوری شده از روی بستر را چرخ كرده و عصاره آنرا زیر پوستی تزریق میكنند و بلا فاصله بطور همزمان درمان با تتراسیكلین را شروع میكنند. معمولا یك عفونت خفیف یا پنهان ایجاد میشود كه با پاسخ ایمنی كنترل میشود.

تشخیص بیماری و مشخصات انگل :

تشخیص بیماری وابسته به علائم كلینیكی ، شناختی از شدت بیماری و گستردگی ناقلین یا كنه ها و بررسی لامهای تهیه شده ( گسترش خون و یا گسترش غدد لنفاوی ) میباشد. غیر از فرمهای مختلف داخل گویچه قرمزی در گسترشهای خونی، شیزونت مشخصه مهم و خوبی در آلودگی با گونه های ‏T. Parva و T. annulata درگسترشهای تهیه شده از غدد لنفاوی میباشد. سلولهای آلوده ممكن است در گسترشهای فشاری Impression smears تمام بافتها دیده شوند.

بیماریزایی:

شیزونت گونه T. parva ابتدا در مرحله پاتوژنیك باعث افزایش سلولهای سیستم لنفاوی Lymphoproliferative شده و بعد از آن باعث تخریب سلولهای فوق Lymphodestructive میشود. حیوان مبتلا دارای علائم تورم غدد لنفی، تب، مقداری افزایش تنفس، تنگی نفس و گاهی اسهال میباشد. ضایعات بعد از مرگ شامل تورم و پرخونی غدد لنفاوی، ذات الریه بینابینی Interstitial pneumonia و ادم مابین لبی interlobular oedema ، ضایعات تخریشی erosion , ulcer در شیردان و التهاب روده بهمراه نكروز غدد پیرز peyer´s patches و در حالتهای طولانی تر نفوذ سلولهای لنفاوی lymphocytic infiltration به كلیه ها كه شبیه سكته كلیوی infarct بنظر آمده و یا بهمراه ترمبوز و ischaemic necrosis میباشد. در حیوانات بهبود یافته گاهی در اثر عود بیماری سندرم عصبی چرخش Turning sickness دیده می شود.
خصوصیات بیماری زایی در اثر شیزونت T. annulata تقریبا شبیه ‍T. parva می باشد ولی مرحله پیروپلاسمی ممكن است پاتوژنیك تر بوده و باعث كم خونی و زردی شود.

تكنیكهای تشخیصی :
تیلریا انگل تك یاخته أی اجباری داخل سلولی تمام خانواده گاوهای وحشی و اهلی ( Bovidae ) در جهان میباشد. و بعضی از گونه ها نشخواركنندگان كوچك را نیز مبتلا می نماید. بوسیله كنه های خانواده Ixodidae منتقل میشوند و دارای زندگی پیچیده ای در مهره داران و بی مهره ها میباشند. شش گونه تیلریا گاو را آلوده میكند كه دو تا از آنها بیماری زایی بیشتری دارند : اولی بنامT. parva كه بیماری East coast fever , Corridor disease , Zimbabwean theileriosis را ایجاد و دومی T. annulata باعث بیماری Tropical theileriosis میشود.
دیگر گونه ها كه شامل T. sergenti, T. buffeli, T. orientalis, T. taurotragi, T. mutans هستند معمولا بیماری زایی خفیفی ایجاد میكنند. گونه T. velifera غیر بیماری زا است. اغلب این گونه ها پس آلوده كردن دام ایجاد دام ناقل در دامهای بهبود یافته را مینمایند اما هیچ نوع داده وآماری در رابطه با رل این ناقلین در انتقال بیماری در حالت طبیعی وجود ندارد.

گاوهای بومی درمناطق بومی آلوده ممكن است بیماری را تحمل نموده و یا به بیماری خفیف و تحت كلینیكی مبتلا شوند. اما گاوهای غیر بومی حسا س بوده و در صورت ابتلا علائم شدیدی نشان داده و یا تلف می شوند.
همانطوریكه قبلا هم گفته شد شیزونت ها در گسترش تهیه شده از غدد لنفاوی مشخصه خوبی برای آلودگی با T. parva, T. annulata میباشد. شیزونت گونه T. taurotragi در گسترش رنگ آمیزی شده بوسیله گیمسا بخوبی قابل تشخیص نمیباشد.
شیزونت T.mutans نسبت به شیزونت T. parva دارای هسته های بزرگتر، مسطح وبی قاعده میباشد.
فرم پیروپلاسمی T. parva , T. annulata و T. mutans شبیه بهم میباشد. اما معمولا T. annulata , T. mutans بزرگتر و اغلب در حال تقسیم دیده میشود. T. velifera ممكن است بوسیله یك پرده حجاب مانند تشخیص داده شود.

تشخیص سرولوژیكی :

تشخیص وجود پادتن بصورت غیر مستقیم بوسیله IFA ( indirect fluorescent antibody)
بطور گسترده برای تشخیص گونه های مختلف تیلریا بكار می رود. تشخیص نوع آلودگی بخصوص آلودگی با ‍T. parva چندان در بین روشهای ایمنولوژی قابل تمایز نمی باشد. بهترین روش سرولوژی قابل تمایز مابین گونه های تیلریا آزمایش غیر مستقیم پادتن فلورسانس IFA ( Indirect Fluorescent Antibody ) می باشد. در این آزمایش هر دو مرحله شیزونت و پیروپلاسمی بوسیله لام تهیه شده و یا در محلول قابل بررسی می باشند. برای نگهداری محلول یا لامهای تهیه شده در مرحله شیزونتی دمای انجماد (20- تا 70- ) استفاده میشود ولی در مرحله پیروپلاسمی برای نگهداری محلول از دمای 4 درجه یخچال و برای لامها از دمای انجماد میتوان استفاده كرد.
سرمهای مورد آزمایش را با ماده bovine lymphocyte lysate رقیق میكنند و با محلول آنتی ژنی در انكوباتور میگذارند و بعد ضد ایمنوگلوبولین متصل گاوی anti-bovine immunoglubolin conjugate افزوده میشود.

الف- تهیه لام یا اسلاید آنتی ژن شیزونت

آنتی ژن مورد استفاده برای schizont IFA test ازتیره سلولی شیزونت لیمفوبلاستوئید Lymphoblastoid گرفته میشود. كشتهای سلولی را كه دارای رقت 200 میلی لیتر شیزونت در یك لیتر شیزونت های آلوده ( به T. parva ویا T. annulata بوده و حاوی ده میلیون سلول در هر میلی لیتر و حداقل 90% سلولها آلوده میباشند ) باشد را سانتریفیوژ كرده ( بمدت 20 دقیقه در سرعت 200 دور در دقیقه در دمای 4 درجه ) و مایع روئی را دور ریخته و سلولهای ته نشین شده را با 100 میلی لیتر بافر ( Phosphate buffered saline) PBS در دمای 4 درجه و pH 7.2 تا 7.4 مخلوط و دوباره سانتریفیوژ میكنیم. این روش شستشو را سه بار تكرار كرده و در آخرین با رسلولهای ته نشین شده را با 100 میلی لیتر PBS مخلوط كرده تا غلظت نهائی حدودCELL/ML 7 10 درآید.

گسترش نازك از محلول سلولی را روی اسلاید حفره دار ( از جنس تفلن )‌تهیه كرده ویا روی لام معمولی را با استفاده از لاك ناخن تقسیم كنیم . هر گسترش باید دارای 50 تا 80 سلول سالم در هر دید میكروسكوپی Field ‌باشد (‌وقتیكه با بزرگنمایی 40 با روغن Immersion بررسی شود) .بوسیله پی پت 100μl آنتی ژنها را با مكش یكدفعه روی لام ریخته كه پس از توزیع محلول شیزنت یا پیروپلاسم یك لایه Monolayer در هر كدام باقی می ماند. اینكار را برای هر حفره انجام داده تا مایع تمام شود. بااین روش تقریبا“‌می توان 600لام با كیفیت خوب كه حاوی 6 هزار سلول در هر نقطه آنتی ژن باشد بدست آورد . گسترشها را درمعرض هوا خشك كرده ودراستن بمدت ده دقیقه ثابت كرده (‌Fixation)‌ وبطور جداگانه دردستمال كاغذی پیچیده و سپس در كاغذ آلومینیم (‌فویل آلومینیم ‌) ‌وبعد در محفظه ضد آب و هوا دردمای20- درجه سانتیگرادیا 70 - درجه سانتیگراد نگه می داریم . دردمای –20 درجه سانتیگراد بمدت یكسال قابل استفاده هستند ودردرمای –70 درجه سانتیگراد بمدت طولانی تر (‌دردمای یخچال 4 درجه سانتیگراد بمدت چهارماه قابل نگهداری هستند).

ب- محلول آنتی ژن شیزونت

ابتدا 500 میلی لیتر از محلول T.annalataیا T. parva سلولهای آلوده با غلظت 10 6cell/ml سلول سانترفیوژكرده (‌در 150 g دور دردقیقه برای ده دقیقه در دمای 4 درجه )‌ وسلولهای ته نشین شده در100سی سیPBS سرد دوبار شستشو می دهیم.
قابلیت زنده بودن سلولها را بوسیله اوزین Eosin یا Trypan blue بررسی میشود (‌كه باید بیش از %90‌باشد )‌محلول سلولها باید درمحلول سرم فیریولوژی سرد رقیق شود تا غلظت 7 10سلول (/ml Cell) بدست آید دراین حجم ، ‌دوبرابرآن را محلول سرد شده حاوی 80%‌ استن و 0.1 % فرمالین در PBS قطره قطره اضافه كرده (‌در درمای –20 درجه )‌تا درمدت 24 ساعت به تثبیت رسد.

سلولهای ثابت شده را سه بار شستشو داده (‌در سرم فیولوژی سرد شده دردمای 4 درجه ) و‌در 200 دور دردقیقه بمدت 20 دقیقه سانترفیوژ میكنیم. بعد از آخرین شتشو سلولهای ته نشین شده را در سرم فیولوژی رقیق كرده تا غلظت 107/ml بدست آید . بمیزان 5/0 سی سی سلولهای ثابت شده را جدا جدا برداشت و تقسیم می كنیم .

تهیه اسلاید حاوی آنتی ژن پیروپلاسم:

مرحله پیرپلاسمی گونه های تیلریا را نمی توان دركشت سلول نگهداری یا تهیه نمایند. زیرا آنتی ژن پیروپلاسمی باید از حیوانات زنده آلوده تهیه شود و عفونتهای تجربی بوسیله تزریق زیر پوستی با اسپروزئیت یا كنه های آلوده باT.parva T.taurotragi ,T.annulata , صورت میگیرد. آلودگی گروه انگلی T.sergenti/ T.buffeli/ T.orientalis ,T.mutans or T.velifera بوسیله تزریق داخل رگی خون حیوان ناقل به گاو یا گوساله طحال برداشته و یا تماس با كنه آلوده ایجاد می شود. وقتیكه آلودگی پیروپلاسمی بیش از 5% ‌باشد، صد میلی لیتر خون آلوده آغشته با مواد ضد انعقاد را بخوبی با PBS مخلوط می كنیم . این مخلوط را سانترفیوژ كرده (‌با500دور در دقیقه برای ده دقیقه)‌ و بعدپلاسما و Buffy Coat را جدا كرده و RBC های باقی مانده را بادولیتر PBS رقیق می كنیم. سپس دوباره سانترفیوژ كرده وهمینطور Buffy coat را جدا میكنیم . این عمل رابرای چهار بار تكرار می كنیم و بعد از پنجمین ششتشو، مقداری از RBC های جمع شده Packed RBC را با PBS مخلوط كرده واز آن 5μl روی هر اسلاید می گذاریم. نقاط خشك شده را با متانول تثبیت كرده وبا رنگ آمیزی گیمسا رنگ میكنیم ونهایتا زیرمیكروسكوپ نوری بررسی می كنیم . تقریبا ده هزار اسلاید آنتی ژنی (‌صد هزار نقاط آنتی ژن ) ا ز100سی سی خون آلوده‌ تهیه می شود. اسمیرهای آنتی ژنی را در دمای اتاق خشك كرده وبعد در دمای 4 سانتیگراد درجه در استن بمدت ده دقیقه فیكس میكنیم. اسمیرهای فیكس شده شبیه اسلایدهای آنتی ژنی شیزونت نگهداری میشوند.

محلول یا سوسپانسیون حاوی پیروپلاسم :‌

یك روش تهیه آنتی ژن برای T.parva قبلا“‌شرح داده شد دراین روش صد میلی لیتر از خون حیوانیكه شدیدا“‌ در مرحله آلودگی پیروپلاسمی باشد گرفته و مانند آنچه شرح داده شد،گلبولهای قرمز تجمع كرده را به PBS اضافه كرده تا محلول 5%‌ بدست آید.- در مراحل فوق باید آنتی ژن را استانداردكرد-
تهیه lysate‌Bovine Lymphocyte : این ماده طبق روش Godderis et al. برای بررسی محلول آنتی ژن T. parva بكار می رود . ابتدا یك گوساله سه ماهه كه طحال آنرا برداشته اند را درنظر گرفته و واز طریق تماس با كنه و یا پشه تسه تسهtse Tse آلوده می كنیم وروزانه بمدت چهارهفته با رنگ آمیزی گیمسا بررسی میكنیم . نهایتا بعد از مرگ یا كشتن حیوان از تیموس و غددلنفاوی نمونه برداری می كنیم .

بافتها را به قطعات كوچكتر تقسیم كرده ودر PBS سرد ( در دمای 4 درجه) بهمراه %45 /.0 مواد ضد انعقاد نگهداری میكنیم . سلولها را از بافت بوسیله پارچه MUSLIN جدا كرده و سه بارشتشو با مخلوط PBS-EDTA میدهیم و در دور 200 بمدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتریفیوژ میكنیم . لینفوسیتهای شسته شده را با PBS كه عاری از EDTA باشد، مخلوط می كنیم تا غلظت نهائی CELL/ML 107*5 بدست آید .

روش كار برای تشخیص آنتی بادی فلورسانس :‌

اسلاید شیزونت یا پیروپلاسم را از دمای انجماد، 20- درجه سانتیگراد در آورده و بمدت 30 دقیقه در دمای یخچال، 4 درجه گذاشته و سپس 30 دقیقه دیگر در دمای اتاق میگذاریم.
بوسیله پی پت پاستور 100/μl آنتی ژن را روی هر لام ریخته ودردمای اتاق 37 درجه خشك می كنیم . میتوان برای تلعلع بهتر ودید بهتر از Evansblue نیزبهمراه رنگ فلورسانس استفاده كرد و بعد در گلسیرول 50% در pH 8 میگذاریم تا رنگ Fluorescein isothiocyanate بمدت طولانی تر و عمیق تر اثر گذارد . اسلایدهای تهیه شده تا 72 ساعت در دمای 4 درجه د رتاریكی قابل نگهداری و استفاده میباشند. بدنبال عفونت با اسپروزئیت ها آنتی بادی های تولید شده بر علیه T.parva و T.annulate ابتدا" بین روزهای دهم تا 14 برعلیه شیزونت ودر بین روزهای 15-21 بر علیه پیروپلاسم قابل تشخیص می باشند. پادتنها بعد از بهبودی ناپدید می شوند ووابسته به فاكتورهای متفاوتی از جمله وضعیت ناقل، ‌فاصله مابین درمان، درمعرض قرار گرفتن و تماس دوباره با كنه آلوده تغییر می كنند. معمولا“ ‌4 تا 6 ماه بعد از آلودگی آنتی بادی پائین می آید (‌در صورتیكه تماس دوباره پیش نیاید).
بدنبال آلودگی با T.mutans آنتی بادی در روزهای دهم تا 15 قابل اندازه گیری بوده و بعد از 12-24 ماه پائین میآید.

ب:‌ نیازمندیهای لازم جهت تهیه واكسنها و تشخیص‏های بیولوژیك

1- واكسنهای كشت سلولی برای تیلریا آنولاتا:‌ از اوائل قرن بیستم كه عامل بیماری تیلریا شناخته شد مایه‏كوبی برعلیه بیماری تیلریا مورد نظر قرار گرفت . گرچه یك واكسن زنده با قدرت ایمنی زائی شناخته شده اخیرا“‌به تولید رسیده است چیزی كه بیشتر تا حالا مورد استفاده قرار گرفته كشت سلولی شیزونت تغیرحدت یافته است . برای مقابله با تیلریا آنولاتا نحوه تولید و تست‏های ارزشیابی قبلا“ ‌تشریع شده است . این نوع واكسن بصورت گسترده‏ای در كشورهای ایران ،‌تركیه ،‌هندوستان وروسیه و چین مورد استفاده قرار گرفته است.

مدیریت تهیه بذر واكسن:‌

خصوصیات بذر واكسن: ‌سلولهای آلوده به تیلریا آنولاتا كه بعنوان كشت اولیه مورد استفاده قرار میگیرد از گره های لنفاوی ‌كبد،‌طحال ، كه به روش اسپتیكال از دام آلوده یا مرده جدا میگردد.
روش كشت :‌ سلولهای آلوده در مرحله اول در محیط(Minimun Essential Medium)MEM كه حاوی 20 درصد سرم گوساله وپنی سیلین (100میكروگرم در هرCC ) واسترپتوماسین 50 میكروگرم در CC ومایكوستین 75 میكروگرم درCC در ظروف درب‏دار پلاستیكی مخصوص كشت وارد میشود . محیط كشت یا بصورت لایه تك ردیفی Monolayerویا بصورت مایعSuspension استفاده میگردد.

Safty (‌سلامتی )‌ شیزونت تیلریا آنولاتا با پاساژهای مكرر درمحیط كشت تخفیف حدت می یابد . مكانیزم تخفیف حدت یافتن نامعلوم است ولی بنظر میرسد تعداد تقسیمات سلولی مهمتر از مدت زمان و تعداد پاساژ در محیط كشت میباشد و تیلریا جدا شده از فیلتر نیازمند پاساژ بمدت 4 الی 30 ماه میباشد تا كاملا“ ‌از حدت آن كاسته شود ونیز این زنجیره وقتی كامل میشود كه بعد از هر 20 الی 30 پاساژ به گوساله های حساس تزریق شود . تخفیف حدت وقتی كامل میشود كه محیط كشت در تزریق به دام حساس باعث بوجود آمدن تب ویا اجرام داخل سلولی قابل رؤیت مثل شیوزنت یا‌رینگ تیلریا نشود.

دامهائیكه دارای عفونت باشند بخصوص عفونت‏های ویروسی ممكن است بخوبی به واكسن واكنش نشان ندهند . مایه‏‏كوبی دامها پس از مایه كوبی با واكسن تیلریا ویا همزمان با آن بدون درنظر گرفتن فاصله زمان مناسب توصیه نمیشود بخصوص واكسنهای ویروسی از قبیل واكسن تب برفكی زیرا احتمال تداخل در ایجاد ایمنی برای هردو واكسن وجود دارد.
درایران معمولا“‌مایه‏كوبی دامهای كه بیش از 5 ماه آبستنی دارند توصیه نمیشود در صورتیكه در مطالعاتی كه دراسرائیل انجام شده اثری بر روی آبستنی نداشته است .
بطوركلی دامها میبایست در چند ماه اول زندگی مایه‏كوبی شوند و بادزراپلی كه توسط گزش كنه‏های آلوده دریافت میكند میزان ایمنی در سطح بالای باقی خواهد ماند.

واكسیناسیون دامها برعلیه تیلریا پاروا

دراین روش مایه‏كوبی از روش آلودگی ودرمان‌(‌Infection&Treatment ) استفاده میگردد . این متد براساس آلودگی دامها با كنه‏های آلوده تخفیف حدت نیافته میباشد كه دارای شیوزنت تیلریا میباشند وپس از آلودگی این حیوانات را با تتراسیكلین درمان میكنند . تتراسیكلین باعث كم شدن حدت آلودگی میشود كه در نتیجه آلودگی خفیف كه با درگیر شدن سیستم ایمنی بدن دام قابل كنترل میباشد .حاصل میشود كه این مرحله را بنام Carrier یا ناقل نام میگذارند احتیاط لازم برای جلوگیری از شیوع بیماری ویا وارد شدن تیلریا به ناحیه‏های جدید وپاك امری لازم و ضروری است .

رعایت اصول ایمنی :

‌توصیه ‏های ایمنی ذیل در تهیه و نگهداری و حمل تیلریا پاروا لازم وضروری است .
تهیه كنه‏ها از فیلد:‌آگاهیهای لازم در مورد احتمال آلودگی انسان به عوامل مختلف بیماری زا در حین جمع آوری كنه‏ها بایستی به اطلاع اشخاص درگیر كار رسانده شود . مهمترین عامل بیماری زا در حین جمع آوری كنه ها در فیلد كه تاكنون شناخته شده‏اند شامل تب كریمه كنگو میباشد كه معمولا“‌همراه كنه ‏های جنس هیالوما و بصورت گسترده در مناطقی كه جنس‏های مختلف كنه Rhipicephalus وجود دارد همراه میباشد . بنابراین كسانیكه در جمع آوری كنه‏ها فعالیت می كنند میبایست كاملا“‌از وضعیت بیماری مطلع باشند .

استراتژی واكسیناسیون :‌
بر عكس تیلریا آنولاتا كه در میان سویه های مختلف آن یك ایمنی عمومی وجود دارد در تیلریا پاروا مسائل پیچیده‏تری وجود دارد . معمولا دو راهكار برای حل این مشكل وجود دارد . یكی استفاده از مجموع سه استوك كه از قویترین طیف‏های بومی چندین كشور تهیه شده است میباشد ،‌ این واكسن در كشور مالوی تحت نظر FAO ودر شرایط كاملا“‌ استریل تهیه شده است . اگر این واكسن درمنطقه یا كشوری بتواند جواب دهد باید از راهكار دوم كه عبارتست از تهیه وجدا سازی شیوزنت محلی كه یا با اضافه كردن به واكسن مرحله اول ویا به تنهائی مورد استفاده قرار میگیرد استفاده كرد استراتژی مرحله دوم هم از نظر قیمت تمام شده وهم از نظر زمان گران تر و طولانی‏تر است، ‌بطوریكه ایمنی زائی از طریق آلودگی و درمان موثر است ولی مسائلی از قبیل حمل ونگهداری كنه‏ها وریسك بخطر افتادن مناطق پاك و خطر ناقلین همگی باعث شده كه در فكر شناخت یك آنتی ژن مناسب برای تولید یك واكسن خوب بود.

اقتباس از دستورالعمل OIE (Office International des Epizooties) اكتبر 2001 Chapter 3.2.11 .

**CASSIATORA** · Jun-21-2008, 23:29

معرفی "سندرم لکه سفید" در میگو White Spot Syndrome

در خبرها آمده بود که با شیوع بیماری "لکه سفید" در یازده استخر سایت پرورش میگوی "حله" در استان بوشهر،انتظار می رود امسال با کاهشی حدود 20 درصد در تولید میگوی پرورشی مواجه شویم و در صورت حذف کل مزارع درگیر با این بیماری تا این زمان،تولید کنندگان فقط از بابت هزینه بچه میگو حدود 8 میلیارد ریال خسارت خواهند دید.
این امر مرا بر آن داشت که اطلاعاتی چند در خصوص این بیماری ارائه نمایم.

توزیع جغرافیایی

این بیماری برای اولین بار در سال 1993 در چین گزارش شد و خیلی سریع در بسیاری از کشورهای آسیایی پرورش دهنده میگو منتشر شد.در سال 1999 نیز عفونت و آلودگی به این ویروس بطور گسترده در مزارع پرورشی جنوب،مرکز و شمال ایالات متحده گزارش شده است.وقوع این بیماری در تمام فصول و تمام مراحل پرورشی مشاهده شده است اما به نظر می رسد که بروز این بیماری با نوسانات محیطی ارتباط دارد.عوامل دیگری مثل استرس ناشی از بقایای مواد شیمیایی و حشره کش ها در تسریع روند شیوع این بیماری تقش دارد.

اسامی عمومی و مشخصات میکرو ارگانیسم مولد بیماری

ویروس سندرم لکه سفید(WSSV مخفف White spot syndrome virus) یا کمپلکس باکولوویروس سندرم لکه سفید(WSBV مخفف White spot syndrome baculovirus complex)،ویروسی با DNA بزرگ است که به جنس جدید ویسپوویروس(whispovirus) و تیره Nimaviridae تعلق دارد.این ویروس فقط رده سخت پوستان(Crustaceous) را درگیر می کند.

طیف میزبان
تمام سخت پوستان متعلق به راسته ده پایان(Decapoda)شامل میگوها،لابستر،و خرچنگ به این ویروس حساسند؛اما بیماری لکه سفید اساسا میگوهای پرورشی(خانواده penaeidae)را درگیر می کند.

علائم بیماری و اثر بر روی میزبان

حیوانات مبتلا ممکن است تنها یک یا چند نشانه از نشانه های زیر را بروز دهند اما همچنان بیماری می تواند بدون هیچ علامتی وجود داشته باشد:
- میگوها بی حال و سست می شوند.
- توقف یا کاهش شدید مصرف غذا توسط جانوران دیده می شود.
- ظرف چند روز،میگوهای در حال مرگ در لبه های استخرهای پرورش و نزدیکی سطح آب دیده می شوند.
- میگوهای مبتلا به عفونت حاد نرخ تلفات بالا همراه با مرگ و میر توده ای(تا صد در صد در طی 3 تا 10 روز بعد از شروع علائم کلینیکی)دارند.

علائم کلینیکی بیماری در جانوران مبتلا

- پوسته شل و سست می شود.
- رسوبات سفیدرنگ نمک های کلسیمی در اپیدرم کوتیکول پدیدار شده که این رسوبات در سطح داخلی کوتیکول پشتی مشهودترند.قطر این لکه ها بین 2- 0.5 میلیمتر است و علت نامگذاری بیماری نیز در واقع بروز همین لکه های سفیدرنگ می باشد.
- سطح بدن و اندام های جانبی تیره تر می شود و به علت گستردگی سلول های کوتیکولی حاوی رنگدانه، رنگ بدن میگوهای رو به مرگ به صورتی یا قهوه ای-قرمز متمایل می شود.
- سطح بدن سنگین شده و دستگاه تنفسی با انگل های خارجی مسدود می شود.

ضایعات

ضایعات بوجود آمده روی پوسته می توانند بصورت لکه های ریز تا صفحاتی باشند که چندین میلیمتر قطر دارند.این صفحات نیز می توانند با یکدیگر ادغام شده و صفحات بزرگتری را تشکیل دهند.این ضایعات زمانی بهتر مشاهده می شوند که کوتیکول قسمت cephalothorax برداشته شده،بافت های ضمیمه ای جدا شوند و کوتیکول را بالا گرفته و در مسیر نور مشاهده نماییم.اما با این حال پدیدار شدن لکه های سفیدرنگ روی کوتیکول، راهنمای دقیقی برای پی بردن به بیماری لکه سفید نیست.

تشخیص تفریقی

در غیاب ویروس WSSV،قلیائیت بالا نیز گاهی اوقات ممکن است سبب تشکیل رسوبات کلسیمی در کوتیکول شود.کیفیت پایین آب استخر(غلظت زیاد آمونیاک،اکسیژن پایین،PH بالا یا پایین)نیز ممکن است علائمی شبیه بیماری لکه سفید ایجاد نماید.

انتقال بیماری

- منبع اصلی عفونت در استخرهای پرورش،تخم های حامل ویروس هستند که بصورت عمودی ویروس را از مولد مادر دریافت کرده اند.
- انتقال افقی نیز در این بیماری وجود دارد.آب مهمترین حامل غیر زنده ویروس است.
- انتقال این بیماری از طریق میگوهای آلوده موجود در آب و یا از طریق کانی بالیسم میگوهای مرده یا ضعیف انجام می گیرد.
- بسیاری از سخت پوستان دیگر(حدود 40 گونه)مانند خرچنگ ها،کریل،لابستر و...حاملین این ویروس هستند درصورتیکه ممکن است خود مبتلا نباشند.
- پرندگان می توانند از طریق رها کردن میگوهای صید شده در استخرهای مجاور،بیماری را از استخری به استخر دیگر انتقال دهند.

اقدامات مدیریتی در پیشگیری از بروز بیماری

- جلوگیری از مبادله تجهیزات و وسایل مابین استخرها
- منع استفاده از غذاهای تازه
- حذف منظم و معدوم سازی میگوهای بی حال یا مرده بمحض مشاهده.
در زمان شیوع بیماری نیز:
- قرنطینه استخرهای آلوده همراه با کنترل عبور و مرور انسانی
- معدوم سازی تمام میگوهای مبتلا و در معرض بیماری(از طریق سوزاندن یا دفن کردن)
- تمییز کردن و ضدعفونی استخرهای آلوده

نکاتی چند در خصوص سندرم لکه سفید

- تاکنون مرگ و میر زیادی از بابت این سندرم در بسیاری از کشورها گزارش شده است.
- گزارش ها حاکی از آنست که تولید مزارع پرورش میگو به مدت دو سال تا 40 درصد افت کرده است و بعد از آن در طولانی مدت تنها تا 70 درصد بهبود یافته است.
- مقاومت به ویروس این بیماری در هیچیک از گونه های سخت پوست ذکر شده گزارش نشده است.
- عفونت ممکن است سطح پایینی داشته باشد و در سخت پوستان سالم حالت مزمن داشته باشد یا اینکه شکل حاد به خود بگیرد و منجر به تلفات گردد.
- تکثیر ویروس این بیماری با استرس های محیطی تحریک می شود.
- ویروس لکه سفید می تواند در آب دریا برای 7-4 روز قدرت خود را حفظ کرده و باقی بماند.

ترجمه و تحقیق:مهندس روزبه اردبیلی
فارغ التحصیل رشته مهندسی کشاورزی- علوم دامی از دانشگاه تهران- پردیس ابوریحان

منابع:
http://www.spaquaculture.com
http://www.foodmarketexchange.com
http://www.pac.dfo-mpo.gc.ca
http://www.disease-watch.comخبرگذاری مهر

**CASSIATORA** · Jun-21-2008, 23:33

رهنمون های لازم پیشگیری از بروسلوز برای کارگران کارخانه بسته بندی گوشت

مقدمه
بروسلوز یک نوع بیماری است که ممکن است از حیوانات به انسان منتقل شود. اما در مورد انتقال آن از انسان به انسان هنوز به موردی برخورد نشده است.

وقتی که وضعیت های شیوع بروسلوز توسط پزشکان گزارش می شود می بینیم که شیوع بیماری عمدتا توسط سهل انگاری دامپروران ، کارکنان کشتارگاه و بسته بندی گوشت و گهگاه دامپزشکان رخ می دهد. به همین دلیل دقت ما بر روی ممارست در کار و بهداشت شخصی خوب در کار می باشد.

نحوه شیوع بیماری
بروسلوز می تواند از دامها به انسان با لمس کردن دام و یا در حین کشتار از سه طریق سرایت نماید : تماس ،خوردن و استنشاق
مورد اول (تماس) از طریق تماس بریدگی یا زخم پوست با گوشت دام تازه ذبح شده صورت می گیرد،یا وقتی که مخاط بینی ، لب ها و چشم انسان با ذرات معلق مایعات بافتهای دام تماس می یابد.
سرایت از طریق خوردن ، ممکن است با نوشیدن شیر خام یا خوردن گوشتی که خوب نپخته است ویا با مصرف لبنیات دامی (پنیر) که دارای عامل بیماری می باشد صورت بگیرد. در کارخانجات بسته بندی گوشت منابع اصلی انتقال عامل بیماری از راه دهان (خوردن) ناخن خایی کارگران،خوردن ویا کشیدن سیگار با دستی که با آن کار می کنند و مرتبا با مایعات بافتی دام در تماس است،می باشند.
انتقال از طریق تنفس ممکن است با استنشاق هوای دارای قطرات مایع حاصل از بافتهای بدن صورت می گیرد.

علائم عمده بیماری
علائم گزارش شده بروسلوز در بیماران عبارتند از:

تب ، سردی ، دردهای مفصل ، عرق ، دردهای بدن ، ضعف ، کاهش- وزن ، سردرد ، بی اشتهایی و افسردگی

ممارست های کاری

این رهنمود ها آزمایش همه گاوهای ماده پرورشی را در حراجی ها و کشتارگاهها و همچنین هرساله تست گاوهای شیری را لازم می بیند. دامها سروپوزوتیو با بریدن یکی از گوشها و یا نشان گذاری بر روی گوش از سایر دامها متمایز می شوند.
• گاوها دو تست لخته خون مثبت و تست چرخه شیر برای بروسلا آبرتوس دارند.
مطالعات نشان می دهند که ریسک سرایت به کارگران با افزایش تراکم و تجمع ارگانیسم های بروسلا در محل کار افزایش می یابد.

به همین دلیل ما توصیه می کنیم:
1- کشتار روزانه گاوهای سروپوزوتیو باید روزانه کمتر از 20 الی 25 راس باشد. زیرا کمتر از این تعداد تمرکز ارگانیسم های بروسلوز را پایین آورده و برای ایجاد بیماری بروسلوز کافی نخواهند بود و همچنین شانس کمتری برای سرایت به کارگران خواهد بود.
2- گاوهای گله حاوی بروسلوزیس بایستی در پایان کار کشتار شوند. کارهای انهدام و یا تقلیل ارگانیسم های بروسلا در زمان استراحت شیفت کاری صورت بگیرد.
3- بین دامهای سروپوزوتیو یک فضای لاشه بایستی نگهداشته شود تا جایی که ذرات معلق در هوای بین دو فضا نتوانند انتقال یابند.
4- دست زدن به جنین گاو سروپوزوتیو یا گاوی از گله سروپوزوتیو بایستی خیلی کم انجام شود.
5- رحم به طور کلی درآورده شود و قبل از این كار باز نشود.
6- غدد پستانی بدون برش در داخل درآورده شود و گره های لنفاوی بالای پستان دست نخورده و بدون برش بماند.
7- به هنگام کشتار گاو سروپوزوتیو یا گاودیگر از همان گله،کارگرانی که در جایگاه ذبح هستند دارای ریسک بالایی برای استنشاق ذرات پخش شونده یا ریختن این مواد هستند ، بایستی عینک های حفاظ دار و یا عینک های ایمنی با محافظ جانبی به چشم بزنند و ماسک تنفسی برای جلوگیری از استنشاق ذرات معلق داشته باشد.

بهداشت شخصی

برای جلوگیری از انتقال توسط خوردن :

• خوردن، نوشیدن و سیگارکشیدن در محل کار مجاز نباشد.
• کارگران باید دستهای خود را قبل از ترک محل کار به طورکامل با آب و صابون بشویند.

کمک های اولیه

1– لوازم کمک های اولیه بایستی در محلی قرار بگیرد که در هنگام رخ دادن اتفاقی به سرعت و به سهولت در دسترس باشد.
2– لوازم شستشوی چشم در جای مناسبی قرارگیرد تا در هنگام ریزش مواد به چشم ، مطمئن باشیم که به سرعت می توان اقدامات لازم را انجام داد.
3– درصورت برخورد خون،مدفوع و یامایعات بافتی دام به صورت ،به سرعت با مقادیر زیاد آب شستشو شود. در صورت وقوع جراحت چشم یا در صورت سوختگی ، انجام مراقبت های پزشکی ضروری است.
4– برش های ایجاد شده با چافو ، استخوان ، سوراخ ها ، خراشیدگی ها بی – درنگ گزارش شده و تحت اقدامات کمک های اولیه قرار گیرد. به هرحال وقتی که گاوهای سروپوزوتیو ذبح می شوند کمک های اولیه حتی در صورت ظهور کوچکترین زخم انجام شود.
5– زخم های باز باید کاملا تمیز شود و با یک ماده ضدعفونی کننده ضدعفونی شده و با زخم بند ضد آب مناسبی بسته شود، جاهای بسیار مرطوب بایستی با لاستیک دستکش پوشانده تا اطمینان داشت که خشک می ماند.

آموزش کارگران

در ابتدای استخدام کارگران ، کارگران تازه استخدام شده بایستی از موارد زیر اطلاع داشته باشند :

• ارگانیسم بروسلا به عنوان یک خطر برای سلامتی در محل کارشان است.
• طریقه و دلیل استفاده از هر مورد از لوازم امنیتی
• مزایای ا ستفاده بی درنگ از کمک های اولیه
• علائم خاص بروسلوزیس
• دلایل تست خون در ابتدای استخدام و آگاهی از علائم ظهور بروسلوزیس
• اهمیت بهداشت شخصی و ضرورت منع خوردن ، نوشیدن و سیگار کشیدن در جایگاه کشتار
• دانستن ریسک بالای کار، در زمان ذبح گاو سرپوزوتیو

مراقبت پزشکی

1- هر کارگری که در بخش کشتار کار می کند باید یک نمونه خون برای تست سرولوژیکی بروسلوزیس برای تعیین آخرین وضعیت سرولوژیکی بدهد. نتیجه آزمایش به شناسایی پیشرفت آنتی بادی و تشخیص علائم بیماری که کارگر در آینده آن علائم را نشان خواهد داد کمک می کند.

2- کارگری که علائم پیشرونده در او به وجود بروسلوز دلالت می کند تحت درمان پزشکی قرار گیرد و یک نمونه خون برای تست سرولوژیکی گرفته شود.

3- از وقتی که بروسلوزیس یک بیماری با تشخیص دشوار می باشد اگر گزارش همه موارد تایید شده به رییس نزدیکترین واحد بهداشتی ممکن نباشد در این صورت به اطلاع سازمان همه گیرشناسی وکنترل بیماریهای مسری رسانده شود.

تست سرولوژیکی و تشریح آن

کمتر از 10 میلی خون منعقد شده برای آنالیز در آزمایشگاههای دارای تجهیزات آزمایش سرولوژیکی بروسلوز کافی است.
هر کارگر با تیتر آگلوتیناسیون تا 1:160 یا بیشتر و همراه با نشانه های بروسلوزیس ، به عنوان موارد احتمالی رده بندی می شوند.
موارد مسلم بیماری زمانی است که ارگانیسم بروسلا در کشت باکتریولوژیکی از یک نمونه خون دیده شود.

درمان
درمان بروسلوزیس در انسان شامل معالجه آنتی میکروبیال (ضد میکروبی ) و اقدامات کمکی می باشد./

References

Buchanan, R.M. and Hendricks, S.L. et al., Brucellosis in the
United States 1960-1972: An Abattoir-Associated Disease, Part
III: Epidemiology and Evidence for Acquired Immunity.

Medicine, 53:427-441, 1974
Alleyne, B.C., Orford, R.R., Lacey, B.A. and White, F.M.M.,
Rate of Slaughter May Increase Risk of Human Brucellosis in a
Meat Packing Plant, JOM, Vol. 28, No. 6:445-450, 1986.

HEW Publication No. (CDC) 79-8196, Annual Summary 1978 ,
U.S. Dept. of Health, Education and Welfare. Public Health
Service.

منبع:پارس بيولوژي

امکانات
نمایش نسخه قابل چاپ ارسال بصورت E-Mail
حالات نمایش
حالت خطی تبدیل به حالت فهرستی تبدیل به حالت تک پست

موضوعات مشابه
موضوع	نویسنده	انجمن	پاسخها	آخرین ارسال
تقویم برای فریزر	CASSIATORA	علوم غذایی	0	Feb-27-2008 12:50

کاربرانی که در حال مطالعه این موضوع هستند: 1 (0 عضو و 1 مهمان)